2016 Fiscal Year Research-status Report
高分子取込みABC輸送体の分子機構の解析と改変による多様な物質輸送系の構築
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16K07701
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
丸山 如江 摂南大学, 理工学部, 助教 (90397563)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橋本 渉 京都大学, 農学研究科, 教授 (30273519)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アルギン酸 / ABC輸送体 / 共免疫沈降 / 結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌のABC輸送体（細胞質膜に局在）は基質の輸送サイクルに応じてその構造を変化させる。また、構造変化に伴い、基質結合タンパク質（ペリプラズムに局在）や基質、ATPなどのリガンドとの結合状態も変化する。これまでに、不活性な輸送体を用いて、定常状態（基質輸送前）におけるアルギン酸ABC輸送体の構造を明らかにした。今回、輸送中間状態の構造を調べるために活性を保持したABC輸送体の精製方法を検討した。種々の界面活性剤を用いて組換え大腸菌の膜画分から組換え輸送体を精製し、ATPase活性を指標に各種界面活性剤をスクリーニングすることにより、複数の界面活性剤の組み合わせで酵素活性が検出される条件を見出した。この界面活性剤に溶解した輸送体に、基質結合タンパク質とアルギン酸オリゴ糖、ATPアナログを添加し結晶化条件を探索したところ、定常状態の結晶化条件では結晶が得られず、代わりに、PEG6000と塩化アンモニウムを沈殿剤とした時に、約10μm × 10μm × 10μmの単結晶が得られた。結晶化条件および結晶の形状がこれまでの結晶とは異なるため、定常状態とは異なる構造の結晶であることが期待できる。今後、結晶化条件の最適化を行い、構造決定を目指す。一方、共免疫沈降法を用いて輸送サイクルにおける分子間の相互作用を調べたところ、アルギン酸ABC輸送体が基質結合タンパク質と結合するためには、ATPと輸送基質が必要であることが明らかとなった。つまり、ペリプラズムで基質結合タンパク質が基質を捕捉し、ABC輸送体と接触すること、および細胞質ドメインにATPが結合することが、ABC輸送体の構造変化すなわち基質輸送をひきおこすと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究実施項目である①ABC輸送体の活性保持条件の探索②新規結晶化条件の探索③輸送サイクルにおける分子間相互作用、の全ての項目において一定の成果が得られた。①においては、活性を保持する精製条件を見出した。これは、今後の課題進行において特に重要な意味を持つと考えられる。②においては、これまでに得られなかった条件で新たな結晶が得られ、今後に期待できる。ただし、X線解析に供するには不十分であったため、今後も引き続き条件を検討する必要がある。③に関しては、共免疫沈降法により、分子間の相互作用を解析できることを示した。今後、変異体を用いた相互作用解析などに用いることにより、新たな知見を得ることが期待できる。
以上のように、今年度得られた結果は、次年度以降の研究を進める上で非常に重要な知見である。
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| Strategy for Future Research Activity |
おおむね申請時の計画通りに進捗している為、引き続き計画書に記載の通りに研究を推進する。具体的には以下のように計画してる。
新たに見つかった結晶化条件の最適化を行い、新規コンフォメーションの構造解析を目指す。同時に、申請時の計画通り、基質輸送中間体に構造を固定するためのアミノ酸置換を導入し、その結晶構造解析および機能解析を進める。アミノ酸置換残基についてはすでに候補を絞っているため、速やかに次のステップに進める見通しである。
一方、機能解析と応用を目指して、ABC輸送体の基質輸送活性の測定系を改良し、物質取込み系評価の基盤を確立する。つづいて、アルギン酸と結合した物質の取り込み能の評価を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
今年度、微生物の培養やタンパク質精製などの繰り返し行う実験の補助のために人件費を計上していたが、補助者を雇用せずに、研究室の学生と協同して実験を実施したため、人件費に余剰が生じた。また、旅費に関しては、所属機関の補助によりまかなうことが出来た為、支出が抑えられた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度の残額は、次年度の消耗品費として使用する。結晶化条件の最適化にかかる実験が来年度に持ち越しとなっているため、結晶化および回折データ測定に必要な器具や試薬などの物品を購入し、効率の良い結晶化スクリーニングを行う予定である。
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