次世代シーケンサーを用いたクロマツにおけるマツノザイセンチュウ感受性遺伝子の探索

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07792
• Research Institution: Forestry and Forest Products Research Institute
• Principal Investigator: 平尾 知士 国立研究開発法人森林総合研究所, 森林バイオ研究センター, 主任研究員 (90457763)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: クロマツ / マツノザイセンチュウ / 感受性遺伝子 / 次世代シーケンサー

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus）感染時にクロマツ（Pinus thunbergii)が自ら病徴の悪化を導くネガティブな生体防御反応とその反応を誘導する遺伝子に着目し、次世代シーケンサーを用いた遺伝子型決定法（Genotyping-by-sequencing；GBS）を利用した遺伝解析から、マツノザイセンチュウ感受性遺伝子の特定を行う。
平成28年度は、抵抗性家系をもとにGBSライブラリーを作成し、次世代シーケンサーによる塩基配列情報の収集を行った。具体的には、抵抗性親を含む抵抗性家系136個体についてDNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いてDNAを抽出し、既報のプロトコルに基づいて、各個体のDNAを制限酵素処理を行った後、次世代シーケンサーで分析するためのジェノタイピングライブラリーを作成した。このとき、各個体の塩基配列が識別できるよう136種類のバーコード配列によるタグ付けを行った。作成したライブラリーをもとに、次世代シーケンサー（Illumina社 Hiseq4000)を用いてペアエンドシーケンスによって塩基配列情報の収集を行った。その結果、生データとして取得した総リード数は約14.3億リードとなり、取得総塩基数は1,585億塩基となった。また、所得した塩基配列情報のうち、各個体（バーコード毎）の平均取得リード数は約1千万リードであり、平均取得塩基数は約10億塩基となった。今年度取得した塩基配列情報をもとに来年度は、塩基配列のクオリティーチェック及びDNA多型（SNP）を検出した上で、高密度連鎖地図の構築を目指す。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成28年度は、次世代シーケンサーによる塩基配列情報の収集を行い、収集した塩基配列情報をもとにDNA多型の検出と高密度連鎖地図の作成を行う予定であった。しかし、次世代シーケンサーで分析するためのジェノタイピングライブラリーの構築に多大な時間を要したため、次世代シーケンサーによる塩基配列情報の収集までに留まった。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度に取得した塩基配列情報をもとに平成29年度は、各個体で得られた塩基配列のクオリティーチェック及びDNA多型（SNP）を検出した上で、高密度連鎖地図の構築を目指す。また、高密度連鎖地図の情報と抵抗性家系の形質情報を利用した遺伝統計解析を行うことで、感受性形成津に寄与する遺伝子座を特定する。

Causes of Carryover

平成28年度は、得られた塩基配列情報に対して、次世代シーケンサーのデータ解析に必要な遺伝統計解析のパイプラインを構築する予定であった。しかし、次世代シーケンサーで分析するためのジェノタイピングライブラリーの構築に時間を要したため、次世代シーケンサーによる塩基配列情報の収集までに留まり、遺伝統計解析のパイプラインの構築までに至らなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成29年度は、平成28年度に引き続き塩基配列情報の収集を行うとともに、次世代シーケンサーのデータ解析に必要な遺伝統計解析のパイプラインを構築する予定であり、データ収集および開発費に使用する予定である。