2017 Fiscal Year Research-status Report
コイヘルパーT細胞亜集団の同定－抗原特異的クローン化T細胞株を用いた検討－
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16K07881
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
森友 忠昭 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20239677)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ヘルパーT細胞 / 魚類 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度研究においては，主に効率よくコイT細胞クローンを得る方法の確立を目指した．すなわち，T細胞増殖因子であるコイ・インターロイキン2（IL-2）の組換えタンパク質を作製し，コイT細胞への増殖効果の有無を測定した．
コイは2種類のIL-2遺伝子（IL-2A，IL-2B）を有しているが，これらの遺伝子をクローニングし，大腸菌によるタンパク発現系を用いてIL-2AおよびIL-2Bの組換えタンパク質（rcIL-2A，rcIL-2B）を作製した．これらコイIL-2の活性は，申請者らがすでに確立しているコイT細胞培養系を用いて調べた．すなわち，コイのリンパ組織でもある腎臓から白血球を分離し，支持細胞（ギンブナ胸腺由来 GTS9細胞株）上に播種すると，ヘルパーT細胞（Th）が選択的に増殖する．これらTh 細胞を回収し48 穴プレートに 1×105個/mL の濃度で播種し，これに rcIL-2AまたはrcIL-2B を終濃度 0, 1, 10, 100 および 1000 ng/mL になるよう加え、30℃、5％CO2存在下で培養した．
rcIL-2AおよびIL-2Bとも，1 ng/mL 以上の濃度でコイ Th 細胞の活発な増殖が認められた．特に，100 ng/mLのrcIL-2 存在下で最大の細胞増殖効果を示した．すなわち，無処理群においては，培養9日目までに培養開始時の細胞数の約1.45 倍の細胞増殖しか認められなかったのに対し，100 ng/mLのrcIL-2存在下においては，当初の細胞数の約 2.7 倍まで細胞増殖が認められた．
コイ IL-2は哺乳類のIL-2と同様にTh細胞へ作用し，増殖を促進することがわかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成28年度の研究で，哺乳類と同様コイにおいても混交リンパ球反応（MLR）にてT細胞の増殖がおこることを示した．そこで29年度はMLRで増殖したT細胞をさらに，コイrcIL-2等を加える等してクローニングし，抗原特異的（アロ反応性）T細胞クローンを得るべく研究を行っていた．しかし，実験途中で使用していたコイが停電などで全滅したため，研究を遂行することが困難となった．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度の研究では，昨年行えなかった，混合リンパ球反応（MLR）によって増殖した，アロ反応性のT細胞の単クローン培養を試みる．
すでに28年度研究において，我々はResponderのコイに別の個体の白血球（Stimulator）で免疫しておき，その後，これらResponderとStimulatorの白血球を混和・培養することで，抗原特異的なTh細胞の培養が可能であることを示した．平成30年度はこのMLRで増殖した抗原特異的なコイT細胞を抗原（Stimulator白血球）や組換えコイIL-2在下で培養し，さらなるT細胞の増幅を試みる．そして我々がすでに開発している方法でクローン化Th細胞株を作製する予定である．これらの解析により，従来作製が難しかった活性化T細胞由来の細胞株であることが確認できれば，魚類においてもヘルパーT細胞亜集団の存在を調べることができると考えられる．
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[Journal Article] Identification of novel polymorphisms and two distinct haplotype structures in dog leukocyte antigen class I genes: DLA-88, DLA-12 and DLA-642018
Author(s)
Jiro Miyamae, Shingo Suzuki, Fumihiko Katakura, Sae Uno, Mizuki Tanaka, Masaharu Okano, Taro Matsumoto, Jerzy K. Kulski, Tadaaki Moritomo, Takashi Shiina
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Journal Title
Immunogenetics
Volume: 70
Pages: 237-255
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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