2017 Fiscal Year Research-status Report

低分子化合物によるスプライス部位選択制御の分子機構解明と疾患原因変異への応用

Research Project

Project/Area Number	16K08225
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	米田宏北海道大学, 薬学研究院, 講師 (60431318)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	スプライシング / 低分子化合物 / RNA-seq
Outline of Annual Research Achievements	本研究ではpre-mRNAスプライシングにおける基質認識の正確性が保証される仕組みについてケミカルバイロジーのアプローチで取り組んでいる。具体的には、イントロンの3'末端に変異を導入したレポーター遺伝子において、変異イントロンのスプライシングを促進する化合物をこれまでに取得しており、その作用解析を通じて、なぜ通常はその部位でのスプライシングが抑制されるのかを明らかにすべく研究を進めている。すでに化合物処理条件でのトランスクリプトーム全体の変動を検出するRNA-seqを行い、大まかな解析を行なっていたが、昨年度はさらに先進ゲノム支援の協力を受け、より詳細な解析を実施した。その結果、化合物で新たにスプライシングが誘導されるイントロンは化合物なしでスプライシングされる恒常的なイントロン同様、ある程度まではスプライソソームの組み立てが行われている可能性が示唆された。また、類似の活性を示す化合物をデータベース解析から同定し、その解析結果からこれらの化合物処理で共通に変化する遺伝子群が同定され、その生理的な意義と化合物の標的との関係についての考察が可能となった。この標的候補分子が実際に細胞内で化合物作用の発揮に関わるかを調べるため、標的候補遺伝子群をノックダウンにより発現抑制した条件で化合物を作用させ、レポーター遺伝子のスプライシングへの影響を検討したところ、特定の遺伝子のノックダウン条件下では、化合物の作用が減弱したり、化合物の構造によっては活性が増加するなど興味深い現象が見られた。これらの実験結果は標的についての仮説と合致するものであり、次年度はこの点についてさらに詳しく解析を行う予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 化合物の作用標的の同定は決まった方法がなく、どの化合物でも手探りで進む部分が大きいが、本年度は我々の化合物の作用標的をRNA-seqの解析結果と、公共データベースにある多数の化合物のRNA-seqの結果を同じ手法で再解析して比較することで、類似の作用を示す化合物群を同定することができた。これらの化合物が同一分子を標的としていることから、この分子が実際にレポーター実験で見られるような陽性化合物のスプライシングへの影響に関与しているかをノックダウン実験で調べるところまで行っている。これは予定した通りのストラテジーではなく、各時点で得られた結果をもとに次の方策へとつなげた結果であるものの、進捗状況としてはおおむね順調と考えている。
Strategy for Future Research Activity	本年度はこれまでに得られた標的の情報をもとに、化合物と標的タンパク質やその近縁分子との相互作用を詳細に検討することで、RNA-seqやレポーターアッセイで見られる化合物作用の強度やその変化が説明できるか調べていく。同じ標的を持つ化合物でも完全に同じ影響を示すことはなく、その作用機序や結合性の違いが反映されると予想され、ノックダウン実験で見られた標的候補分子のノックダウン条件下での活性変動を具体的な分子と分子の相互作用データから裏付けられるか検討する。また、ゲノム支援の協力により、活性向上類縁体のRNA-seqの結果も得られており、その詳細な解析をこれまで同様に実施すること、またスプライシング以外でも化合物の顕著なトランスクリプトームへの作用も見つかっていることから、その変動についても解析を行い、化合物と標的の関係からその現象が起こる仕組みについても明らかにしていく予定である。
Causes of Carryover	多数のRNA-seqデータの解析には比較的高性能なPCや大きな容量のハードディスクが必要であるが、研究室既存のシステムで実施することができたこと、高度な解析をゲノム支援で実施していただいたため新たな機器の購入は必要なかった。また、ノックダウン実験では候補遺伝子群に対するsiRNAライブラリーを準備して実施したが、十分なノックダウン効率を示したオリゴが確率よく得られたため、再合成などの回数も少なく済み、結果として予算から使用額を節約できることとなった。次年度使用額については、類似化合物や分子機構の詳細を検討する上で必要な抗体の購入などに充てる予定である。