2016 Fiscal Year Research-status Report
てんかん時脳内PGE2濃度正常化に向けた血液脳関門排出機能減弱分子機構解明
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16K08365
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
赤沼 伸乙 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (30467089)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
細谷 健一 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 教授 (70301033)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 血液脳関門 / プロスタグランジン / PGE2 / てんかん / L-グルタミン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、脳内過剰L-グルタミン酸関連疾患のてんかん時における、血液脳関門プロスタグランジン (PG) 輸送機能減弱の分子要因解明を目標としている。
脳において最も豊富に存在するPG種、PGD2のin vivoラット血液脳関門を介した排出輸送を評価した結果、大脳皮質に投与した[3H]PGD2は消失半減期16分と速やかに消失し、その消失は有機アニオン輸送担体Oat3及びMrp4の基質もしくは阻害剤共存によって有意に阻害された。従って、脳から血液脳関門を介したPGD2排出輸送へのOat3及びMrp4の関与が示唆された。てんかん誘発について一酸化窒素及び神経細胞に発現する一酸化窒素合成酵素の関与が報告されている。脳に一酸化窒素ドナーであるナトリウムニトロプルシド処理後に[3H]PGD2排出輸送を解析した結果、その排出は統計学的有意に減弱した。従って、血液脳関門PGD2排出輸送プロセスは一酸化窒素介在シグナル伝達経路にて一部制御されることが示唆された。
この減弱メカニズム詳細解明に向け、ex vivo単離脳血管輸送解析の確立を試みた。Oat3及びMrp4共に基質として報告されているcyclic AMP (cAMP) の蛍光標識体、Fluo-cAMPを血液脳関門Oat3/Mrp4機能評価プローブとして評価した。単離した脳毛細血管に対しFluo-cAMPを加えインキュベートした結果、血管内腔へのFluo-AMPの蓄積が観察された。その蓄積を定量化し、各種Oat3及びMrp4阻害剤を共存させた条件下にて同様の解析を行ったところ、血管内腔におけるFluo-cAMPは50%以上有意に阻害された。従って、本解析は血液脳関門実体である脳毛細血管におけるOat3及びMrp4の機能変動を評価するにあたり有用であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
血液脳関門プロスタグランジン排出変動メカニズムとしてけいれん発作・てんかん発症に関係することが示唆されている経路が一部関与することが見出された。プロスタグランジン排出減弱を探る経路を探る上でのきっかけとなる平成28年度の研究計画について概ね達成している。また、すでにin vitro/ex vivo環境下における、てんかん模倣条件下についての検討も進めており、処理溶液及び濃度についても検討を進めており、平成29年度以降に計画しているその詳細な分子機構の解明とin vivoにおける寄与実証に向けての準備も現在進行中である。以上の点から、本計画研究はおおむね順調に進んでいるものと判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度以降に、条件検討が完了したex vivo単離脳毛細血管を用いた解析を通じ、てんかん時プロスタグランジン排出輸送減弱に関与すると考えられる血液脳関門L-グルタミン酸及び一酸化窒素が起点となるシグナル伝達経路の同定を試みる。具体的には、脳毛細血管内腔へのFluo-cAMP蓄積度を指標として、L-グルタミン酸関連受容体及び一酸化窒素にて誘発されるシグナル経路に対するアゴニスト・アンタゴニストを用い、その蓄積度の変動を評価する。必要に応じて、毛細血管蓄積度も可溶化後lysateの蛍光強度測定を通じ、血液脳関門の脳側膜と血液側膜それぞれに局在する輸送担体の寄与を分離して評価する。
また、PGE2排出抑制に関与するシグナル経路を阻害するような薬物は、てんかんの発作発症・病態進行の抑制に繋がると期待され、その検証は極めて重要である。この抑制をin vivo薬理学的に評価するため、平成29年度初期は前述の解析と並行して、てんかんモデル動物作出をカイニン酸やピロカルピン連続投与にて検討する。各種薬理学的スコアを参照に、解析を行う上で妥当な投与間隔・投与条件を決定する。
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| Causes of Carryover |
平成28年度は現有機器・器材を用いた解析が主であり、必要最小限の消耗品と実験動物 (ラット) の使用に留まったため、次年度使用額が生じた。特に、脳毛細血管単離とそれを用いた解析に用いるチャンバーについて、申請者が海外留学した先にオーダーメイドした料金をベースとして作成を依頼していたが、その費用が日本における業者では想定よりも安価にて配慮頂いたため、多額な作成依頼料を必要としなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額の多くは、平成28年度に多く使用を計画していた消耗品に充てることを想定している。平成29年度の計画として、蛍光基質を用いたイメージングによる、PGE2を基質とする血液脳関門輸送担体のL-グルタミン酸処理時における変動メカニズム解明を試みる予定であることから、各種L-グルタミン酸受容体アゴニスト・アンタゴニスト、そしてその下流シグナル系に影響を与える試薬を購入する予定である。また、てんかんモデル動物の作出に向け、てんかん発作を誘発する薬物 (カイニン酸・ピロカルピン）を大量に使用する予定である。
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