2017 Fiscal Year Research-status Report
上皮間葉転換に着目した新規バイオマーカー探索による脳、腎糖尿病疾患の治療法開発
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16K08439
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
齊藤 成 生理学研究所, 脳機能計測・支援センター, 特任助教 (10456444)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丹生谷 正史 東北医科薬科大学, 医学部, 講師 (00228256)
大野 伸彦 自治医科大学, 医学部, 准教授 (10432155)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 糖尿病性尿細管障害 / スフィンゴ脂質 / オートファゴソーム / ミトコンドリア障害 / 上皮間葉転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2 型糖尿病早期発症マウスモデル (High Fat Induced Obesity C57BL/6J mouse)用いてSGLT阻害剤(Phlorizin)投与した。20W HFD群で、体重増加と高血糖、高インスリン血症及び高脂血症(HDL・TG)を認めた。近位尿細管(PCT)障害マーカー(尿中KIM1とL-FABP)が上昇した。HFD群にSGLT阻害剤を投与することにより、尿糖の排泄増加に伴う血糖値低下を認め、TGが上昇し、クレアチンが減少を伴う尿排泄増加が認められた。同時に、尿中L-FABP/クレアチンが上昇し、尿中KIM1/クレアチン変化は認められず、TGF-beta/クレアチン排泄が上昇した。また、尿中TGF-betaの変化に伴い、HFD群の近位尿細管(PCT)でKi67(Mitotic marker)が上昇し、SGLT阻害剤の投与により、PCTのKi67は減少し、PCT近傍の支持組織細胞で上昇した。
LC-MSによる腎臓皮質のリン脂質解析を行った。STD群に比べHFD群で、sphingomyelinの減少とphosphatidyl cholinの増加が認められ、HFD群SGLT投与群でceramide-1-phosphateが上昇した。
SBF-SEMとSTEM-EDX解析で、HFD群のPCT-foot process(FP)の形態異常と、PCT(S1～S3)のmitochondriaの断片化と、S2を中心に巨大なオートファゴソーム様(At)にリン脂質の集積を認められた。HFD群にSGLT阻害剤を投与すると、Atは減少し、Lysosomeと癒合する空胞形成が認められた。顕微ラマン分光解析で、Atにsphingomyelinが認められた。SGLT阻害剤によりPCTの上皮細胞内膜の再編成し、酸化脂肪酸結合蛋白であるL-FABPと共に除去される機構が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度に、生理学研究所電顕室のSBF-SEMを用いて、糸球体の毛細血管網を取り巻く足細胞の突起が血管内皮細胞もしくはメサンギウム細胞とコンタクトを確認したところ、20W高脂肪食群では明らかなコンタクトが認められなかった。一方、近位尿細管においては、フットプロセスと血管内皮とのコンタクトが基底膜を貫き、近尿細管フットプロセスの融合も認められた。
STEM-EDXとラマン顕微鏡解析およびLC-MS解析結果より、スフィンゴ脂質の蓄積が近位尿細管のS2領域に多く認められ、スフィンゴ脂質が近位尿細管上皮細胞のメディエーターとして、Ki67(Mitotic Marker)の上昇に影響していることと、TGF-beta/クレアチニンの尿中排泄が上昇していることから、上皮間葉転換が実際に起きているかの確認と、SGLT阻害剤投与により、近位近位尿細管上皮細胞のKi67(Mitotic Marker)が減少して、周囲の支持組織のKi67(Mitotic Marker)が活性化し、スフィンゴ脂質の変化を起こすことから、TGF-smad系のシグナル伝達系の影響と上皮間葉転換のマーカー(TGF-beta, NF-kB, Snail, Slung)の蛋白およびmRNAレベルでの発現の確認を進めている。
同時に、電子顕微鏡解析用のエポン厚切り切片の多重蛍光免疫染色法と連続超薄切片のTEM像との相関解析法を論文発表した [Saitoh S et al, Acta et hista 2018]。派生的ではあるが、人およびマウスのランゲルハンス島diffuse type isletの内分泌細胞内にzymogen-like granulesが存在する事も示すことができた。包埋前染色法を用いての免疫染色を行い、TEMもしくはSBF-SEMで解析する方法 [特開2017-166898]と免疫電顕の技術を進めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年４月より、生理学研究所から藤田保健衛生大学 医学部 解剖学講座IIに異動となった。動物実験の行動解析を含めて、動物実験報告書を申請し、早期に再開する。平成29年度までに採取した凍結および固定サンプルも用いて、生化学解析を進める。SBF-SEM解析も継続して、生理学研究所の電顕室で行えるように、共同研究計画の申請を行う。
本プロジェクトとは別の共同研究(分担研究者及び研究協力者)において、ヒトの巣状糸球体硬化症変化が見られると糸球体の毛細血管網を取り巻く足細胞の突起が血管内皮細胞もしくはメサンギウム細胞とコンタクトが得られることをSBF-SEMで確認し、平成29年度の米国腎臓学会で発表したこともあり、動物実験に２型糖尿病発症の多遺伝子変異マウス(NONcNZO10/LtJ)を加えることとした。２型糖尿病発症の多遺伝子変異マウス(NONcNZO10/LtJ)に高脂肪食を与えることで、膵臓のランゲルハンス島の過形成と軽度の糸球体硬化症変化などの進行した２型糖尿病発症の表現系を得られる。加えて、本研究の分担者との別の共同研究で、ラットの電極刺激実験で、海馬CA1の血管周囲のアストロサイトのフットプロセスの脱落が起こり、血液脳関門の破壊が起きることもSBF-SEMで確認できた。
また、動物実験の3Rを進め、microCTも用いて、飼育中のマウスの臓器の肉眼形態を簡易なフォローも行う。試料採取後の脳や腎臓、肝臓の腹部臓器を丸ごと、en bloc固定を行ったのちに、microCTで解析を行うことで、肉眼レベル解像度を高めて、そのスライス断面を作成し、FE-SEMで広い視野で観察を行ったのちに、SBF-SEM解析を行っていく。
血液、尿、臓器組織の採取したものを、藤田保健衛生大学の共同利用施設の質量分析機(LC-MS)を用いてスフィンゴ脂質の解析を進めていく。
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| Causes of Carryover |
平成28年度までに購入した消耗品等に加え、生理学研究所での電顕室や研究機器を使用したため、研究が進める上での消耗品のコストを抑えることができた。その一方で、国際学会での発表や情報収集のための学会参加などで、予定よりも旅費を繰り上げて行った。２名の分担研究者への分担金は、前年度分で十分賄えたこともあり、今年度は見送り、平成30年度に繰り越すことを了承を得て、予算執行の変更を行った。
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