2016 Fiscal Year Research-status Report
減数分裂染色体タンパク質のステージ特異的リン酸化とその機能的意義
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16K08461
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
向後 寛 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (20282387)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 減数分裂 / リン酸化 / モノクローナル抗体 / ゲノム編集 / 点変異 / 対合 / キナーゼ / DNA切断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類の減数分裂に必須なタンパク質であるHORMAD1やその近縁分子で減数分裂チェックポイントに必要なHORMAD2は、複数のリン酸化修飾を受けることが知られているが、各リン酸化の機能的意義はまだわかっていない。今年度の研究成果として、HORMAD1のSer307周辺のいくつかのリン酸化状態に特異的なモノクローナル抗体を樹立し免疫組織染色を行うことにより、これらのリン酸化がSPO11によるDNA切断の調節機構に重要な役割を果たす可能性が示された。現在主に形態学的手法により、このリン酸化にATMキナーゼが関与する可能性や、DNA切断を行う分子複合体がHORMAD1の特定のリン酸化状態依存的に減数分裂染色体にリクルートされるかどうか解析中である。またHORMAD2について、以前にリン酸化特異的抗体を用いた形態学的解析によりSer284のリン酸化がチェックポイント機構に関与する可能性を示唆する結果を得ているが、このリン酸化の重要性を直接的に検証するため、ゲノム編集の手法によりSer284をアラニン（非リン酸化型）やアスパラギン酸（リン酸化模倣型）に置換した変異マウスの作製を行い、実際にこれらの点変異を導入することに成功した。今後各ホモ変異マウスを作製し遺伝的背景を均一にした上で表現型解析を行うことにより、これらのリン酸化の機能的意義を明らかにすることが出来ると思われる。また、ゲノム編集の副産物としてHORMAD2のＣ末端を欠損する変異マウスも複数作出された。これらのマウスもHORMAD2の分子機能を理解するために重要であるため次年度以降解析を進め、リン酸化部位の点変異マウスとの表現型の違い等を明らかにする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HORMAD1のリン酸化については、モノクローナル抗体を用いた局在解析を順調に進めることが出来た結果、各リン酸化の減数分裂ステージ特異性やDNA切断依存性などを明らかにすることが出来た。一方、当初予定してたリン酸化特異的に結合する因子の同定には着手できていないので、その点ではやや遅れ気味ではあるが次年度以降に着実に進展させる予定である。HORMAD2のリン酸化については、以前にザイゴテン期後期の対合不全チェック機構に関与する可能性があるリン酸化部位を同定していたが、今年度の成果としてゲノム編集により該当するリン酸化部位の点変異マウスの作出に成功した。この点では明らかに当初の計画以上の成果が得られたと考えており、総合的に概ね順調な進展状況と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画としてはHORMAD1のリン酸化を主に解析する予定であったが、最近、海外の研究者との共同研究の成果として、HORMAD2の対合不全チェック機構について非常に重要な新知見が得られた（論文投稿中）。その知見から示唆される対合チェックポイントの分子機構を明らかにするために、今年度に作出したHORMAD2の点変異やC末端欠損を持つマウスは非常に有用であると考えており、これらを活用して対合チェックポイントについても解析を進めていきたいと考えている。またHORMAD1およびHORMAD2のリン酸化特異的に結合するタンパク質複合体の同定方法について複数の方法のメリット、デメリットの検討を行っているが、特定の時期の複数の変異マウス精巣を材料とした、二次元電気泳動法による比較プロテオーム解析が現時点で最良と考えている。現在、解析に必要な材料の採取を進めており、次年度には対合チェックポイントやSPO11によるDNA切断制御に関与する分子複合体の構成タンパク質を同定できるように計画を実行していきたい。
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| Causes of Carryover |
初年度にゲノム編集による点変異マウスの作製に着手することが出来たため、その作製や解析に必要な費用等が不足し、３０万円の前倒し請求をした。しかし実際にはその一部が年度末までには未使用となったため約２０万円の次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前倒し分を前年度に１０万円使用したという状況なので、今年度の予算としては、当初の計画の額とあまり違いはなく、ほぼ予定通りに使用したいと考えている。具体的には、HORMAD2の複数の変異マウスの表現型解析や、リン酸化特異的結合タンパク質の同定に必要な試薬等の購入が主な使途となる予定で、それ以外ではHORMAD1のリン酸化部位の点変異マウスの作製にも着手する予定である。
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