2016 Fiscal Year Research-status Report
骨格筋の興奮収縮連関を調節するジャンクトフィリンの新たな機能
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16K08491
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
中田 勉 信州大学, 学術研究院医学系, 講師 (70452141)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 興奮収縮連関 / 骨格筋 / 結合膜構造 / L型カルシウムチャネル / ジャンクトフィリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，骨格筋L型カルシウムチャネルの正常な機能と細胞内局在における，ジャンクトフィリンの役割について検討を行っている。当初の実験計画では本年度にin vitroの実験を行う予定であったが，予備検討の進捗状況の変化により，次年度に行う予定であったin vivoでの実験を先に行うこととした。
これまで，骨格筋のL型カルシウムチャネルの正常な局在と機能に，ジャンクトフィリンが重要な役割を果たしていることを，培養細胞系で明らかにしてきた。また，ジャンクトフィリンの膜貫通部位欠失変異体（JP1ΔTM）が，L型カルシウムチャネルの正常な細胞内局在を阻害することを明らかにした。そこで，JP1ΔTMを，アデノ随伴ウイルスベクターによってマウス前脛骨筋に導入する実験系の確立を目指した。JP1ΔTM導入用ウイルスベクターは，常法の通りHEK293細胞にプラスミドを共発現することで作製し，ウイルスタイターは定量的PCR法によって決定した。作製したウイルスは筋肉内に直接注射した。感染10日後に免疫染色を行った結果，JP1ΔTMはほぼ全ての筋線維で発現が認められた。この条件で解析を行った結果，正常群と比較して有意に筋力と特異張力（単位面積当たりの筋力）が減少していた。筋の断面積に変化は認められなかった。現在，この筋力低下のメカニズムをより詳細に解析するために，単離短趾屈筋繊維を用いたカルシウムイメージングを行っており，これも減少傾向を示すデータを得ている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の実験計画では，本年度に培養細胞を用いた検討を行い，次年度以降にマウスを用いた検討を行う予定であった。しかし，アデノ随伴ウイルスを用いたin vivoでの予備実験の結果が良好であったため，計画を繰り上げin vivoでの実験を今年度に行った。次年度の計画であった筋力測定なども遂行できたため，順調に進捗していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初in vitroで筋管を分化させ，遺伝子導入などを行う計画を立てていたが，in vivoでの解析の方が生理的条件に近いと考えられる。今年度，アデノ随伴ウイルスによるin vivoでの遺伝子導入系が確立できたため，次年度以降はこの実験系を中心に解析を行う。JP1ΔTMを前脛骨筋または短趾屈筋に強制発現を行い，カルシウムイメージングを行い，興奮収縮連関の異常について検討を行う。またL型カルシウムチャネルの局在や，リアノジン受容体とのカップリングがどのように変化しているか明らかにするために，免疫染色やProximity Ligationアッセイを行う。
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