敗血症性ショックにおけるオレキシンの新規中枢神経系制御機序の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08541
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 入鹿山 容子 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 研究員 (90312834)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 桜井 武 筑波大学, 医学医療系, 教授 (60251055)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: オレキシン / 敗血症性ショック / リポポリサッカライド / DREADD / 炎症性サイトカイン / 体温

Outline of Annual Research Achievements

敗血症は、細菌による感染を発端として、細菌が産生するエンドトキシンなどの毒素が全身に広がり、播種性血管内凝固症候群（DIC)、多臓器不全、ショックなどを引き起こす全身疾患である。重症度に幅があり敗血症、重症敗血症、敗血症性ショックの順で重篤化し、まだ有効な治療法が確立していない。申請者らは敗血症性ショックモデルマウスに神経ペプチドであるオレキシンを末梢投与すると、オレキシンが全身性炎症状態で障害を受けた血液脳関門を通過し、中枢に作用してバイタルサイン（体温と心拍数）を回復することを見出した。神経活動の指標であるFosを用いた免疫組織学的手法による探索の結果、このオレキシンによる体温の回復作用には延髄縫線核セロトニン神経が活性化されることが重要であることがわかった（Ogawa, Irukayama-Tomobe, eLife, 2016)。さらに延髄縫線核にアデノ随伴ウィルス（AAV）ベクターを用いて抑制性（hM4Di)DREADD(Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs) を発現させた場合に、オレキシンの体温上昇作用が消失することを確認した。また、オレキシンの生存率の改善効果に伴いカテコールアミンとコルチコステロンが増加し、炎症性サイトカインが減少することを見出した。このことからオレキシンの生存率改善には抗炎症作用も関連しているのではないかと考えられた。敗血症性ショックモデルマウスにオレキシンを持続投与した後、再度Fosを用いた免疫組織学的手法を用いて標的部位の探索を行った。オレキシン持続投与4時間後ではTMN (histaminergic tuberomammillary hypothalamic nucleus)、VTA(ventral tegmental area)が有意に活性化され、22時間後ではNTS(nucleus of solitary tract)が活性化されるということがわかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度、アデノ随伴ウィルス（AAV)を用いて興奮性DREADD(hM3Di)を、Pet1-Creマウス（セロトニン神経特異的にCreリコンビナーゼを発現させたマウス）のセロトニン神経に発現させ、CNOによりセロトニン神経を特異的に興奮させることで、敗血症性ショック時でのオレキシンによる体温の回復、抗炎症効果（炎症性サイトカインレベルの低下）が再現されるかを調べる予定であったが、Pet1-Creマウスの繁殖の遅れと、ウィルスインジェクションの手法による感染部位のばらつきのため、効果を正確に評価できなかった。そのため、Pet1-CreマウスとfloxM3マウスを掛け合わせたダブルトランスジェニックマウスを作成した。その後、LPSにより全身炎症を引き起こすとともに、CNOを投与することでオレキシンの効果が再現されるかどうかを検討する予定であったが、繁殖に時間がかかっており次年度に持ち越されてしまった。

Strategy for Future Research Activity

1.敗血症性ショックモデルマウスにオレキシンを持続投与した後、Fosを用いた免疫組織学的手法により標的部位の探索をした結果、オレキシン持続投与4時間後ではTMN、VTAが有意に活性化され、22時間後ではNTSが活性化されていた。今後はマウスの例数を増やし検証する。

2. Pet1-CreマウスとfloxM3マウスを掛け合わせたダブルトランスジェニックマウスを用いて、LPSにより全身性炎症を引き起こすとともに、CNOを投与するとオレキシンの効果が再現されるかどうかをさらに検討する

Causes of Carryover

（理由）ウィルスインジェクションの実験のため、ウィルス作成キットなどの購入に予算を計上していたが、予定したほどの実験ができなかったため、次年度に使用額を持ち越した。
（使用計画）1.敗血症性ショックモデルマウスにオレキシンを持続投与した後、Fosを用いた免疫組織学的方法により標的部位を探索するためにマウス、抗体を購入する。
2. Pet1-CreマウスとfloxM3マウスを掛け合わせたダブルトランスジェニックマウスを用いて、LPSにより全身性炎症を引き起こした場合、CNOの持続投与によりオレキシンの効果が再現されるかどうかをさらに検討するために、CNOなどの試薬、サイトカイン測定用のルミネックスを購入する。また、LPSの効力の指標として、投与後の体温を測定するためにテレメトリー送信機を購入する。

Research Products

• [Presentation] Orexin agonist improves inflammation-induced immobility (2018)
  • Author(s): Shuntaro Uchida, Yoko Irukayama-Tomobe, Yasuhiro Ogawa, Takuto Yamaguchi, Katsuyasu Sakurai, Shingo Soya, Tsuyoshi Saito, Hiroshi Nagase, Masashi Yanagisawa, Takeshi Sakurai
  • Organizer: WCP 2018, 18th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology（第18回 国際薬理学・臨床薬理学会議）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Orexin agonist improves inflammation-induced immobility (2017)
  • Author(s): Shuntaro Uchida, Yoko Irukayama-Tomobe, Yasuhiro Ogawa, Takuto Yamaguchi, Yukiko Namekawa, Ryo Fukai, Tsuyoshi Nemoto, Hiromu Tominaga, Yukiko Ishikawa, Katsuyasu Sakurai, Shingo Soya, Tsuyoshi Saito, Hiroshi Nagase, Masashi Yanagisawa, Takeshi Sakurai.
  • Organizer: The 6th Annual IIIS Symposium