2017 Fiscal Year Research-status Report

Functional analysis of methylated DNA-binding protein CIBZ in mouse embryogenesis

Research Project

Project/Area Number	16K08587
Research Institution	Nara Institute of Science and Technology
Principal Investigator	松田永照奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (00335481)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	胚発生 / DNAメチル化 / DNAメチル化結合たんぱく質 / DNAメチル化酵素 / 胎生致死 / Cre-loxP
Outline of Annual Research Achievements	哺乳類のDNAメチル化は遺伝子の発現調節を介して、発生や分化などの機能に重要な役割を果たしていることが知られている。DNAメチル化酵素のノックアウトマウスが胎生致死であることから、DNAメチル化が正常な胚発生に必須であることが分かった。DNAメチル化機構はメチル化酵素とメチル化されたDNAに結合するタンパク質（MBP）より構成されているため、MBPも胚発生に重要であることが考えられる。しかし、既知のMBPをコードする遺伝子の欠損マウスは初期胚の発生に顕著な異常をきたすという報告がないため、胚発生におけるMBPの役割が不明である。我々が同定した新規MBPであるCIBZがマウス胚発生に影響を与えるかどうかを調べるため、Cre-loxPシステムを用いた条件付きマウス（flox-neo/+）からCIBZのヘテロ接合体マウスの作製を試みた。その結果、生まれたマウスの中にCIBZヘテロ接合体マウスが確認されなかったことから、CIBZヘテロ接合体マウスが胎生致死であることが示唆された。本研究では、CIBZヘテロ接合体マウスが胎生致死かどうかを確証した上で、胎生致死の時期と原因を明らかにする。昨年は、遺伝子の発現を確実に欠損させる方法である条件付きのCIBZマウス（flox/+）よりCIBZのヘテロ接合体マウスの作製を試みた。その結果、出生マウスの中にはCIBZヘテロ接合体マウスが存在しなかったことと、CIBZヘテロ接合体胚は胎生E11.5以降に確認されなかったということを見出した。今年は、CIBZのヘテロ接合体胚は胎生E6.5から発生に異常が観察され、胎生E9.5以降にその存在が確認されなかったということが分かった。この結果より、CIBZがマウスの初期胚発生に必須であることが明らかとなった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason CIBZのflox/+ マウスとCre を全身発現するマウスと交配させ、CIBZヘテロ接合体マウスの有無を検証した。その結果、CIBZヘテロ接合体の胎仔はE9.5以降の存在は確認されなかったということが明らかとなった。 CIBZが着床後の胚発生のどのステージに影響を与えるかを調べるため、顕微鏡よる観察記録と胎子のパラフィン切片によるヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）の解析を行った。その結果、CIBZヘテロ接合体の胎仔は他の遺伝型の同腹胎仔と比較して、胎生E6.5では約半分の胎仔が小さく、胎生E7.5では全ての胎仔がさらに小さく、E8.5ではもっと顕著になり、E9.5では胎仔の存在が確認されなかったということが分かった。
Strategy for Future Research Activity	CIBZヘテロマウスにより胎仔死亡の原因を明らかにする目的で、着床後の各胎生期（E6.5～8.5）の胎仔からパラフィン切片を作製した後、細胞増殖と細胞死を調べる。 CIBZの欠損が着床前の胚発生に与える影響を調べるため、2細胞期胚（E1.5）と胚盤胞（E3.5）の体外培養を行い、CIBZヘテロ胚と他の遺伝型の同腹胚の違い（増殖と分化、細胞死、胚の大きさと形態など）を調べる。CIBZの欠損が着床前の胚発生への影響が確認されたら、培養した各時期の胚を回収して関連遺伝子の発現（ｍRNAとタンパク質）を調べる。胚発生の各時期（E1.5～E13.5）におけるCIBZの発現（強さと部位）を調べるため、抗CIBZ抗体による免疫蛍光染色、X-Gal染色、リアルタイムPCRを行う。
Causes of Carryover	CIBZヘテロ接合体胚による胎生致死の時期と原因の実験が予想より時間がかかったため、Cre-ERマウスを注文しなかった。 CIBZの欠損が心筋などに影響を与えるかどうかを検証するため、CIBZのflox/+ マウスとCre-ERマウスを交配させる。Cre-ER（CAGG Cre-ERTM 、Jackson Lab）マウスの購入に充てる予定である。