2016 Fiscal Year Research-status Report
E3ユビキチンリガーゼによるインフラマソーム活性制御
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16K08772
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
鈴木 志穂 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (80444074)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | インフラマソーム / E3ユビキチンリガーゼ / 炎症応答 / 赤痢菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
赤痢菌、サルモネラ菌などの病原細菌の感染に対し、宿主は菌体をマクロファージに取り込んだ後、菌体由来分子を認識してインフラマソームを活性化させ炎症性サイトカインの産生・分泌を誘導し、最終的に激しい炎症応答を起こす。どのような因子群がインフラマソームの活性をコントロールするのかについては、未だそのメカニズムの全容解明には至っておらず、これからの研究課題である。近年、インフラマソームを構成するタンパク質がユビキチン化修飾を受けており、インフラマソームの活性に影響することを示唆する研究例が複数報告されている。また我々のこれまでの研究においても、インフラマソームの活性にユビキチン化修飾が何らかの形で関与していることを示す傾向が認められていた。本研究ではインフラマソーム活性化とユビキチン化との関係性について着目し、主に赤痢菌およびサルモネラ菌を感染モデルに用い、腸粘膜感染性病原細菌の感染時に誘導されるインフラマソーム活性化をコントロールする因子の特定、及びその分子メカニズムを明らかにすることを目的として実験を行った。今年度得られた研究成果としては、はじめにインフラマソーム活性をコントロールする因子を探索するため、GST pulldown法、Y2Hスクリーニング、免疫沈降法の手段を用い、インフラマソームと相互作用するタンパク質のスクリーニングを行った。次に、上記により得られた各候補タンパク質のsiRNAノックダウンを行い、ノックダウン細胞に赤痢菌やサルモネラ菌を感染させインフラマソームの応答を検証することにより、インフラマソームの活性の強さに影響を及ぼすタンパク質を特定した。その結果、新規のインフラマソームレギュレーターとしてあるE3ユビキチンリガーゼを特定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の進捗状況については、ほぼ当初の予定通りに進行している。本年度4月に研究代表者の所属研究機関の異動があり、ラボの移転と研究機器類のセットアップのため実験が実施できない期間があった。そのため研究計画の遅延が心配されたが、他のラボの協力を得る事ができ大きな遅れが生じることなく実験計画を実施することができた。新所属先でのセットアップが遅れている共焦点レーザー顕微鏡については、東京大学医科学研究所の共同研究先の設備を借りてイメージング解析を行い、データを得ることができた。現在は、新所属先の研究設備のセットアップがほぼ完了した状況であるため、来年度以降は本研究課題の実施に支障はないと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題の今後の研究方針としては、ほぼ当初の計画どおりに実行する予定である。現時点で大きな変更点はない。来年度の研究計画としては、まずスクリーニングにより得られたE3リガーゼのcDNAを発現用ベクターにクローニングしてトランスフェクションを行い、タンパク質を細胞内で過剰発現させた状態でインフラマソーム活性に対する影響を検証する。インフラマソーム活性化の評価方法としてはCaspase-1 活性体(p20, p10)のイムノブロット検出、及びIL-1bのELISA測定、共焦点レーザー顕微鏡を用いたFLICAイメージングの実施を計画している。次に、スクリーニングにより特定したE3リガーゼがどのタンパク質をターゲットにしどのような相互作用をするのかを検証する。具体的には、免疫沈降、イムノヒスト解析等の手段を用いて両因子の相互作用を確認する。次に、ユビキチン化の関連性を検証するために、コトランスフェクション実験、half-life実験, 293T細胞内におけるユビキチン化の検証、精製タンパク質を用いたin vitroのアッセイ系等を行う予定である。また、細胞内における両因子の経時変化とインフラマソーム活性の経時変化とを、共焦点レーザー顕微鏡を用いたイムノヒスト解析、Caspase-1 p10のイムノブロット検出及びIL-1b ELISA測定により検証する。追加する実験項目としては、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子ノックアウト法が本研究課題において非常に有効なツールである事から、本システムの導入・立ち上げを予定している。具体的にはスクリーニングにより特定した標的遺伝子をCRISPR/Cas9システムによりノックアウトしたマクロファージ細胞の作成を計画している。
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| Causes of Carryover |
当該年度1-3月に実施を予定していた実験計画について、学会発表や学務・講義実習とのスケジュール調整の結果、翌年度の４月に一部の実験を移動させた。その分の経費が、次年度使用額として発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
使途としては、実験に使用するための試薬・培地等の購入経費に充てることを予定している。
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Research Products
(5 results)
