2018 Fiscal Year Research-status Report

黄色ブドウ球菌新規TAシステムによるDNAトポロジー制御機構に関する研究

Research Project

Project/Area Number	16K08776
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	加藤文紀広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 助教 (70452589)
Project Period (FY)	2016-10-21 – 2020-03-31
Keywords	DNA gyrase inhibitor / Toxin-antitoxin system / Staphylococcus aureus
Outline of Annual Research Achievements	トキシン・アンチトキシンシステムは細菌及び古細菌において広く存在する機構であり、細胞死、ストレス応答、病原性因子発現制御、薬剤抵抗性であるパーシスター形成に置いて注目されている。新たに見出した黄色ブドウ球菌のTAシステムでDNAジャイレースを阻害するトキシンの詳細な機能解析を目的として研究を行なった。当該年度は、トキシンによるDNAジャイレース阻害作用を解明するために、標的となるサブユニット及び反応ステップの解明試みた。大腸菌でDNAジャイレースのサブユニットA及びBを別々に発現させ精製したが、サブユニットAの精製は成功したが、サブユニットBは活性のある状態で精製するに至っておらず、標的サブユニットの特定までは至っていない。また、in vitroにおけるDNAジャイレース阻害解析から、直鎖状のDNAが検出された事からDNA・DNAジャイレース・トキシンの三者複合体の形成及びDNAジャイレースによる一度DNAを切断した後に再結合する反応を阻害していることが推測された。さらに、DNAジャイレースの阻害作用を詳細に解明するにあたり重要なタンパク質の構造を放射光真空紫外円二色性分光法により、タンパク質の二次構造を明らかにした。その結果、昨年度までに明らかにしているトキシンの活性に重要である27番目のアミノ酸残基を含む２２番目から３２番目のアミノ酸残基の領域でアルファヘリックス構造を形成していることを明らかにした。DNAジャイレース及びDNAとの複合体形成に関連する重要なアミノ酸残基であることが推測され、トキシンの機能を詳細に解明する上で非常に有用な知見を得た。当初の計画からやや遅れているが、タンパク質の構造解析に関しては、当初の計画以上に進展した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初、黄色ブドウ球菌におけるDNAジャイレースを阻害するトキシンの生物学的な役割を明らかにするため、遺伝子欠損株の解析を行なったが、生物学的な役割を見出すに至っていない。しかしながら、DNAジャイレースの阻害作用を詳細に解明するにあたり、in vitroにおけるDNAジャイレース活性阻害実験結果からトキシンはDNAジャイレースが一度DNAを切断した後に再結合する反応を阻害していることが推測された。さらに、詳細な機能解析をする上で重要なタンパク質の構造の解明を行なった。タンパク質の構造解析としてX線結晶構造解析及びNMRによる解析があるが、本実験では放射光真空紫外円二色性分光法により、タンパク質の二次構造を明らかにした。その結果、トキシンの活性に重要である27番目のアミノ酸を含む２２番目から３２番目のアミノ酸残基の領域でアルファヘリックス構造を形成していることを明らかにした。引き続き、黄色ブドウ球菌におけるトキシン・アンチトキシンシステムの生物学的な役割を明らかにするために遺伝子過剰発現株を作製し、薬剤感受性、病原性因子の産生及び遺伝子発現の解析している。
Strategy for Future Research Activity	生物に置いてDNAトポイソメラーゼの変化はDNAの複製、修復、転写、組み替え等の様々な機能制御に関与している。そこで黄色ブドウ球菌における生物学的な役割を明らかにするため、遺伝子欠損株および遺伝子過剰発現株を用いて、薬剤抵抗性に関与するパーシスター形成、病原性の変化を解析する。次世代シークエンサーによるRNA seq解析からトキシンの生物学的な役割の解明を試みる。また、本実験を遂行するにあたり黄色ブドウ球菌細胞内において遺伝子発現を厳密に制御するプラスミドベクターを開発をする。
Causes of Carryover	例年、年度末（3月）に開催される日本細菌学会総会にて研究報告を行う予定であったが、開催時期が翌月の次年度4月となったため旅費に使用する。