2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K08786
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
阿部 章夫 北里大学, 感染制御科学府, 教授 (50184205)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | III型分泌装置 / ボルデテラ属細菌 / 気管支敗血症菌 / 百日咳菌 / エフェクター / BspR / Bcr4 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
百日咳菌ならびに気管支敗血症菌は，III型分泌装置を介してエフェクターとよばれる病原因子を宿主細胞内に注入することで気道での長期定着を確立している。これまでの研究で，BspRはエフェクター発現における負の制御因子として機能することを明らかにしてきたが，その詳細については不明である。BspRは他のエフェクターと同様に，III型分泌装置によって菌体外に分泌される。非分泌型となるように変異を導入したBspRは，本来の負の制御因子としての効果が増強されることを明らかにしてきた。一方，III型分泌装置の構成に関わるタンパク質をコードするbsc遺伝子座には機能未知なタンパク質であるBcr4がコードされているが，この遺伝子の欠損では，III型分泌タンパク質の菌体外分泌が認められず，また，菌体内でのIII型分泌タンパク質の産生量も低下していた。興味深いことに，ΔBcr4ΔBspRの二重欠損株は，ΔBcr4と同様にIII型分泌タンパク質の分泌が阻害されるが，III型分泌タンパク質の産生量はΔBspRと同程度であった。以上の結果より，III型分泌装置の機能が阻害されると，BspRによる負の制御がより強く働くことが明らかとした。さらに，Bcr4はIII型分泌タンパク質の分泌に不可欠な因子であることを明らかにした。III型分泌装置の制御におけるBspRとBcr4の機能を解析していくことで，ボルデテラ属細菌のIII型分泌装置の制御機構がより詳細に解明できると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで気管支敗血症菌において，III型分泌装置の欠損では菌体内のエフェクター量が減少することが明らかになっていたが，他の菌属ではこのような現象は認められず，長らく謎であった。BspRのホモログはAchromobacter属細菌の一部に認められるが，その他の菌属には認められない。今回の実験で，III型分泌装置の機能阻害でBspRによる負の制御が強く働くために，他菌属にはない分泌プロファイルを示すことが推察された。しかし，何故，ボルデテラ属細菌は他菌属にはない分泌制御を行うのかについては，今後の解析が必要である。非分泌型のBspRは負の制御因子としての性質が増大されるが，本来のBspRと非分泌型のBspRの菌体内局在ならびにBspRと相互作用する因子を解析することで，ボルデテラ属細菌におけるIII型分泌装置の特殊な制御機構についてさらなる解析を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
非分泌型のBspRならびに過剰発現株においては，III型分泌タンパク質の強い産生抑制が認められる。一方，Bcr4の過剰発現株では，III型分泌タンパク質の産生増強が認められ，両者の制御は相反関係にある。その一方で，非分泌型BspRの菌体内における量は，BspR野生型とほぼ同じで菌体内での蓄積は観察されなかった。これらのことから，菌体内でのBspRの局在が変化することでIII型分泌装置を制御していることが推察された。BspRの過剰発現ではIII型分泌装置の発現を強く抑制してしまうので（前年度の結果より），BspRのN末端に低分子の蛍光タンパク質を発現するようなゲノム改変をおこない，bspRのコピー数には影響を及ぼさない変異株を構築することができた。今後は蛍光タンパク質を付与したBspRを用いて1分子蛍光イメージング法にてBspRの動態を解析することが可能である。可視化できるBspRを利用することで，BspRの機能をさらに精査するとともに，BspRならびにBcr4にタグを付加してプルダウンアッセイをおこない，両者におけるIII型分泌装置の制御機構の全体像を明らかにする予定である。Bcr4はIII型分泌装置の構成因子をコードするbsc遺伝子座に存在しているが，緑膿菌にそのホモログが見出されるのみで，BspRと同様に他菌属に高度に保存されている因子ではない。負の制御因子であるBspRの欠損株では，病原性に関わるエフェクターの過剰発現が観察されるが，マウスを用いた感染実験ではむしろ病原性が低下していた。このように，BspRを介したIII型分泌装置の制御はボルデテラ属細菌の病原因子のファインチューニングに必須であり，Bcr4を介した制御を含めて精査する必要がある。本研究を通して，ボルデテラ属細菌のユニークな制御機構を理解することで，本菌の病原性発揮のメカニズムをより詳細に解析することが可能である。
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