2016 Fiscal Year Research-status Report
Angptl2による新規マクロファージ活性化機構とその生理的意義の解明
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16K08845
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
海川 正人 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00325838)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Angptl2 / 炎症 / マクロファージ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Angptl2は腹腔マクロファージを活性化し、IL-6、TNFαなどの炎症性サイトカインの産生を誘導する。本研究ではAngptl2 がどのような分子メカニズムで免疫担当細胞に作用するか明らかにする事を目的とした。
本年度は、HEK293培養細胞由来の分泌型Angptl2 蛋白質の性状解析を行い、安定した腹腔マクロファージ活性化能を持つAngptl2を産生、精製する条件を検討した。Angptl2産生HEK293細胞の培養日数が進むと、培養液中にcoiled-coil領域で切断された分子量3万の C末端の割合が増加するが、培養液から分離精製したAngptl2の腹腔マクロファージ活性化能は 培養３日目以降から検出され、４日目、５日目，６日目と強くなることが明らかとなった。培養時間の増加に伴って増加するAngtl2断片が活性を示す可能性が考えられたが、ゲルろ過により分離したAngptl2 C末端断片は活性を示さなかった。しかし、全長のAngptl2はデキストラン・高架橋アガロースのゲルろ過では溶出されず、腹腔マクロファージに炎症性サイトカインを誘導する活性も全ての溶出画分から検出できなかった。また、 脱ペプチドを目的とした透析処理後も精製蛋白質の活性は失われなかったことから、Angptl2の活性はAngptl2蛋白質の糖や脂質など何らかの修飾によるもの、あるいはAngptl2に結合する蛋白質以外の物質に依存している可能性が示唆された。次いで、Angptl2 またはLPSで処理した腹腔マクロファージの遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイ法により比較した。Angptl2特異的に発現が誘導される遺伝子として、Ig-likeドメインを有する受容体など複数見出されたことから、Angptl2の腹腔マクロファージ活性化機構はLPSによる活性化機構と異なっている部分がある事が明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Angptl2の精製ロットによるマクロファージ活性化能のばらつきがあったため、今年度は当初予定していなかった精製Angptl2-flag 蛋白質の性状解析と、安定した腹腔マクロファージ活性化能を持つAngptl2-flag の産生、精製条件の検討を行った。そのため、予定していた腹腔マクロファージ特異的なAngptl2受容体の同定実験の着手が遅れている。しかしながらAngptl2の腹腔マクロファージ活性化誘導には、単にAngptl2蛋白質だけではなく、なんらかの修飾、何らかの物質の結合が関与している可能性が示唆され、Angptl2蛋白質の性状の理解を深めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に予定していた腹腔マクロファージ特異的なAngptl2受容体の同定を試みる。腹腔マクロファージの遺伝子発現ライブラリーを作製し、Baf3細胞あるいはHEK293T細胞に導入する。受容体を発現する細胞はAngptl2の結合が強くなると考えられるので、Angptl2の結合能を指標にFACSを用いてAngptl2結合膜蛋白質を発現している細胞のスクリーニングを行う。Angptl2結合能を示す細胞群に対して、Angptl2処理がMAPKやPI3Kの活性化を誘導するか、NFkBの核移行を誘導するか検証し、Angptl2の受容体として機能しているか検討する。目的とする受容体候補遺伝子を持つ細胞を分離後、導入遺伝子の同定を行う。
さらに、これまでにDNAマイクロアレイ解析で見出されたAngptl2処理特異的に誘導される複数の膜蛋白質遺伝子をBaf3細胞あるいはHEK293T細胞に導入し、同様な手法で受容体の候補として解析を行う。
また、Angptl2特異的抗体を作成したので、 Angptl2が 生体内でどの臓器に、どのように存在しているか免疫組織学的に解析し、その生理的働きを推測するための生理学的基礎を築く。Angptl2の存在が確認できる臓器、組織に存在する細胞群から細胞内蛋白質のリン酸化やAngtptl2の結合能を指標にAngptl2が作用する細胞の分離を試み、腹腔マクロファージ以外のAngptl2の標的細胞の探索を行う。
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| Causes of Carryover |
当初予定になかったAngptl2蛋白質の性状解析が必要であると判断し、優先して行った為、予定していた腹腔マクロファージ特異的なAngptl2受容体の同定実験の着手が遅れた。そのためその解析にかかる予算を次年度に持ち越すこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
初年度に予定していた腹腔マクロファージ特異的なAngptl2受容体の同定実験に用いる。
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