炎症・疼痛制御における肥満細胞、マクロファージ高硫酸化プロテオグリカンの機能解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08999
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 羽渕 脩躬 愛知医科大学, 公私立大学の部局等, 客員教授 (90024067)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 羽渕 弘子 愛知医科大学, 公私立大学の部局等, 客員研究員 (90329821)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 骨髄由来肥満細胞 / 膝関節炎 / モノヨード酢酸 / Fat pad / 疼痛 / 高硫酸化プロテオグリカン / トリプターゼ

Outline of Annual Research Achievements

【概要】マウス骨髄由来肥満細胞（BMMC）が、モノヨード酢酸(MIA)誘起膝関節炎モデルにおいて、関節炎発症時の痛みが低下した後に慢性疼痛を引き起こすことを確認し、肥満細胞顆粒成分であるトリプターゼが疼痛発生に関与する可能性を示した。
【方法】8週齢のマウス（C57BL/6雄）膝にMIA (1 mg/20microl)を注射して関節症モデルを作製した。2週間後にBMMC(1 x 106 cells/20microl)を注射した。マウスをケージ内で自由行動させ、ケージの壁に両前肢を当てた状態で両下肢で立ち上がる回数（a）、処理した下肢と反対側の下肢で立ち上がる回数（b）、処理した下肢で立ち上がる回数（c）を20分間観察し、(b-c)/(a+b+c) x 100を求め、痛み指数とした。BMMC注射7日後に膝蓋下脂肪体からRNAを抽出しqPCRにより調べた。
【結果】痛み指数はMIA 注射後2日目でピークとなり、2週間後にはPBSを注射した対照レベル近くまで低下した。この時点でBMMCを注射すると、痛み指数は再び上昇した。MIAを注射しなかった対照ではBMMCを注射しても痛みは上昇しなかった。Tryptaseは肥満細胞の脱顆粒により放出されるプロテアーゼである。Tryptaseの標的分子PAR2の拮抗ペプチド（FSLLRY-NH2）存在下ではBMMCの注射は痛みを上昇させなかった。MIA注射後BMMCを注射すると、炎症性サイトカインIL-1b、IL-6，TNF-αおよび痛み関連因子NGF、CGRPの発現は、BMMCを注射しなかった対照よりも上昇した。MIA注射後FSLLRY-NH2）存在下でBMMCを注射すると、BMMCだけを注射したときよりも発現は抑制された。
【考察】炎症組織で活性化され脱顆粒したBMMCから放出されたTryptaseが痛みの発症に関与している可能性が示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

骨髄由来肥満細胞BMMCをMIAにより膝関節炎を発症させた関節に注入すると、疼痛を発生させるが、関節炎を起こしていない正常な膝関節に注入しても痛みを発生させないことを、独自に開発した痛みの程度の観察方法により確立した。このことは肥満細胞が炎症を起こした組織で活性化され、慢性疼痛に関与することを強く示唆する。肥満細胞の顆粒成分であるプロテアーゼの一種トリプターゼは、標的細胞の細胞表面に存在する分子PAR-2を分解することにより、標的細胞にシグナルを伝達することが知られている。PAR-2の拮抗ペプチド存在下ではBMMCは痛みを発生させないという本研究の観察は。痛みの発生にトリプターゼが関与する可能性を示す。この観察は、トリプターゼによるシグナル伝達を遮断することが痛みの制御につながる可能性を示し、本研究の重要な成果である。

Strategy for Future Research Activity

肥満細胞には粘膜型肥満細胞と結合組織型肥満細胞がある。BMMCは粘膜型肥満細胞と性質を共有している。結合組織型肥満細胞の特徴をもつCTMCを骨髄細胞から分化誘導し、痛みへの影響をBMMCと比較する。
骨髄細胞から分化させたマクロファージは、分化の条件により炎症を引き起こすM1と炎症治癒に働くM2に分かれる。これらのマクロファージが疼痛発生と制御にどのように関係するかを調べる。
マクロファージへのシグナル分子からのシグナル伝達には、高硫酸化コンドロイチン硫酸であるCS-Eが関与する可能性が考えられる。CS-E欠損マウスで膝関節症を発症させ、BMMCによる疼痛発生と遺伝子発現へのCS-Eの影響を調べる。GFP標識BMMCを注射し、痛みを発生させる条件で脱顆粒が起きるか調べる。

Causes of Carryover

理由　発注した試薬が年度内に納品されなかった。
使用計画　次年度の消耗品費と合わせて使用する。