2016 Fiscal Year Research-status Report
新規遺伝子改変法によるメサンギウムの糸球体形成と糖尿病性腎症への系譜的役割の解明
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16K09619
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
長井 幸二郎 徳島大学, 病院, 講師 (40542048)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岸 誠司 徳島大学, 病院, 助教 (10519507)
冨永 辰也 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 助教 (80425446)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | メサンギウム細胞 / 細胞内シグナル伝達 / 糖尿病性腎症 / 糸球体硬化 / 慢性腎臓病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
in vitroではDynabeads method (Am J Pathol. 2002;161:799-805.)由来の糸球体からメサンギウム細胞を単離する手法を模索し、以前採用していたSieving methodより、簡便かつ効率的にメサンギウム細胞が培養する方法を確立した。
in vivoではまずCre依存的BMP4過剰発現マウスをFoxd1-Creマウスと掛け合わせた。Foxd1-Creマウスは出生時にはメサンギウム細胞に(Development. 2014;141:346-54.)、生後1ヶ月の時点で糸球体全体にCre recombinaseが誘導されるため(J Clin Invest. 2016;126:1926-38.)、出生時糸球体形成へのメサンギウム細胞の役割を明確にするのに有用、かつタモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスとの掛け合わせにて起こる表現型を予測するのに効率的である。その掛け合わせにより、Foxd1-Cre陽性Cre依存的BMP4過剰発現マウスは胎生致死にはならないことが確認できた。この所見から、タモキシフェン誘導型Foxd1-CreマウスとCre依存的BMP4過剰発現マウスの掛け合わせにて、マウス成体においてメサンギウム細胞におけるBMP4過剰発現の表現型を検討することができることが明らかになり、現在、掛け合わせを施行し、目的とするタモキシフェン誘導型Foxd1-Cre陽性Cre依存的BMP4過剰発現マウスを作成している。
また、Cre依存的TGF-β1過剰発現マウスをJackson Laboratoryから、Cre依存的安定化β-catenin 発現マウスを京都大学より入手した。上記と同様にFoxd1-Creマウス、タモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスと掛け合わせ、目的とするマウスを作成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
in vitroにおいてはほぼ順調に進展しており、とくに培養メサンギウム細胞が比較的容易に採取できるようになったことは予想を超えた成果である。
in vivoにおいてはもともと当施設に導入されていたCre依存的BMP4過剰発現マウスに関してはほぼ順調に進展している。逆に、この実験計画に必要とされていたCre依存的TGF-β1過剰発現マウス、Cre依存的安定化β-catenin 発現マウスマウスは、動物実験施設への感染マウスの持ち込みをさけるため、いったんマウスをクリーン化してから当施設に導入したため、掛け合わせをはじめるまでに時間を要した。そのためにやや遅れているとした。
また、下流のmTOR経路に対して抑制的に働き、細胞増殖や肥大の制御を行っているTSC1のfloxed マウスとタモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスを掛け合わせることによりメサンギウム細胞にてmTOR経路の活性化→ ribosomal protein S6のリン酸化をおこしたところTSC1が欠如した糸球体で collagen IVの発現増加やPAM 染色領域の増加がみられ、mTOR経路のみでもメサンギウム細胞にて細胞外基質の増加、形質変化を起こすことをin vivoにて初めて証明できたが、蛋白尿は顕著に排出されなかったことを論文として投稿し、現在in rivisionであり、それも遅れを来した理由となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vitroにおいては掛け合わせたマウスから遺伝子改変されたメサンギウム細胞を採取し、コントロールと比較して細胞外基質、特に通常発現しない不可逆性を左右する要素と考えられるchondrogenic phenotype の特徴、collagen IIの産生に影響するか検討する。また、BMP4 and/or TGF-β1を添加し、BMP4の下流のsmad1のリン酸化、TGF-β1の下流のsmad2,3 のリン酸化、mTOR経路のsurrogate markerであるribosomal protein S6のリン酸化やSox9の発現をwesternblottingにて検討する。細胞増殖はMTT assay、アポトーシスはcleaved caspase-3の染色やwesternblottingにて、collagen I,II,IV,Fibronectinといった細胞外基質、Wnt2BなどのWnt proteinや共受容体FrizzledsとLRP5/6の発現はRNAを採取し、リアルタイムPCRにて経時的に定量し、スクリーニングする。β-cateninやtarget geneであるcyclin D1、c-myc、Runx2やLEF1、β-cateninの分解を調節するGSK-3βの発現やリン酸化をwesternblottingにて定量化する。β-cateninは免疫染色にて核内への移行の有無を検討する。
in vivoにおいては掛け合わせを続行し、Foxd1-Creマウスとの掛け合わせでは出生時糸球体形成が正常か、12週で表現型が形成されているかを検討する。タモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスとの掛け合わせではヒト糖尿病性腎症に類似した経過をたどるか生後4週、12週と1年の3ポイントで表現型をおう。
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| Causes of Carryover |
購入予定であったウェスタンブロットイメージングシステムを共用のものを利用することにより節約し、その一部を増加する動物の維持費に使用したものの、残金が発生したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
メサンギウム細胞の発生時及び成体や病態における役割を明確にするためにFoxd1-Creマウス、タモキシフェン誘導型Foxd1-Creマウスの両方にCre依存的遺伝子改変マウスを掛け合わせるため、主には、in vivoにおいて、増加する動物の維持費とその解析に使用する予定である。また、in vitroにおいては、新しい培養メサンギウム細胞の採取方法を確立できたので、容易に遺伝子改変マウスから目的とする遺伝子改変メサンギウム細胞を採取できるので、糸球体採取用のdynabeadsの購入、くわえて細胞の機能を解析する内容も増加しているため、抗体やreal time PCRのプライマーの購入も検討している。
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Research Products
(2 results)
