ニッチシグナル阻害によるCD34抗原陰性白血病幹細胞を標的とした抗体療法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09861
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 藤岡 龍哉 関西医科大学, 医学部, 准教授 (70403045)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 薗田 精昭 関西医科大学, 医学部, 教授 (60206688)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 白血病 / 白血病幹細胞 / 抗体療法

Outline of Annual Research Achievements

白血病幹細胞は、正常造血幹細胞の階層制と同様に、CD34+CD38-細胞分画に存在すると考えられてきた（Nature 367: 645, 1994）。しかし我々の提唱する正常造血幹細胞の新たな階層性モデル（Blood 101: 2924, 2003, plenary paper）に基づいて、CD34-HSCのleukemic counterpartとしてCD34-LSCが存在するとの仮説を立て、骨髄内直接移植法を用いたNOG/NSGマウスへのヒト白血病細胞移植実験によりそれを実証した。
移植実験により白血病を再構成した白血病検体を免疫原として、Balb/cマウスに免疫を行い、回収したマウスリンパ球とマウス骨髄種細胞株（SP2/0）と融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製した。これまでにALLに対する3クローン、CMLに対する3クローンのモノクローナル抗体を作製している。これらのうちALLに対する1クローン（303-23）について標的抗原（抗原X）が同定されているが、あらたに別のALLに対する１クローン（303-10）に対して標的抗原の同定を進めている。303-10抗体が強い結合性を示す細胞株KU812を材料として免疫沈降を行い、抗原バンドサンプルを質量分析した。その結果、抗原候補として抗原Yが示された。現在、リコンビナント蛋白を用いたELISAによる確認実験、ついで強制発現系を用いた確認実験を進行させている。
また、さらなる抗白血病効果の判定実験に用いるため抗体の大量増産が必要である。これまでに無血清培地を用いて純度の高い精製抗体を303-10抗体について42mg、303-23について33mg得ており、in vivo実験をおこなうのに十分な量を獲得している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに6クローンのモノクローナル抗体の作製を行っている。
また、そのうち新たに１クローンの抗原同定が予定通り進捗している。
予定通りH29年度以降にはこれらの抗体の抗白血病効果の判定のための実験に移行できる見通しであり、おおむね順調に進展しているといえる。

Strategy for Future Research Activity

すでに、303-10抗体が強い結合性を示す細胞株KU812を材料として免疫沈降を行い、質量分析抗原Yが同定されている。リコンビナント蛋白を用いたELISAによる確認実験、ついで強制発現系を用いた確認実験を行う。
その後、303-10抗体の特性の解析を行う。これまでに303-23抗体を用いて行ったin　vitroにおける抗体添加実験の解析を303-10抗体を用いて行い、in vitroでの抗白血病効果を確認する。さらに、NOG/NSGマウスを用いたin vivoでの抗白血病効果の確認実験をおこなう。NOG/NSGマウスに白血病細胞を移植し、移植後早期（１日以内）からマウスに抗体の投与を開始する。抗体の投与量、間隔、期間を最適化する予備実験を経て、抗白血病効果を判定するための実験を行う。腹腔内注射により投与を行う。アイソタイプ抗体をコントロール群に同様の方法で投与する。抗体投与期間中のマウスの生存率や、終了後に抗体投与群でマウス体内での白血病細胞の増殖が抑制されているかを解析する。

Causes of Carryover

わずかに次年度使用額が発生しているが当該年度の執行率は94.7%であり、おおむね予定通りの執行状況であるといえる。
試薬、物品が数万円以上することが多いため、発生した次年度使用額は通常の範囲であるといえる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に繰り越して使用する計画である。
研究計画がおおむね予定通り進捗しているので、予定の研究計画に沿った使用が可能であると想定される。