2016 Fiscal Year Research-status Report
インフラマソームの制御機構の解明と自己免疫疾患治療への応用
| Project/Area Number |
16K09923
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
三苫 弘喜 九州大学, 大学病院, 助教 (60467909)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | インフラマソーム / IL-1β / IL-18 / 慢性炎症性疾患 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
慢性炎症性疾患の血清において、インフラマソームの活性化で誘導される活性型IL-1βとIL-18を測定した。活動期成人発症スティル病では、IL-1βとIL-18が異常高値であった。間質性肺炎合併皮膚筋炎症例では、IL-18のみが上昇しており、IL-1βの上昇はないか軽度であった。また高疾患活動性関節リウマチ(RA)やベーチェット病では一部の症例でIL-1βのみが上昇しており、IL-18は健常人と有意な差はなかった。
ヒト末梢血単球ではToll様受容体の刺激単独で活性型IL-1β産生が確認され、また活性化血小板との共培養で産生が増強した。活性化血小板と単球の共培養ではcaspase-1の活性化も亢進しており、インフラマソームの活性化が増強することが示された。RAやベーチェット病では血小板の増加と活性化が認められ、単球からのIL-1β産生の一因と考えられた。活性化血小板から産生される分子、伝達物質の阻害剤を用いてIL-1β産生に影響を与える因子のスクリーニングを行ったところ、ATPとCCL5の阻害剤でIL-1β産生が抑制された。抗CCL-5中和抗体でもIL-1β産生は抑制された。血小板と単球の直接的細胞間結合が必要かをtwo-chamber systemで検討したところ、直接結合する方が非接触より強いIL-1βの産生を認めた。次にヒト単球THP-1細胞株でshRNAによる種々のインフラマソーム構成因子のknockdownを行い、血小板共培養によるIL-βの産生はNLRP3とcaspase-1のknockdownで抑制されたことから、NLRP3インフラマソームの活性化を介していることが明らかとなった。末梢血単球ではpro-IL-18産生は低く、活性型IL-18の産生は検出できなかった。以上より、RAとベーチェット病におけるIL-1βの産生は単球からの産生が主体であると考えられた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
IL-18の産生がみられる成人スティル病、間質性肺炎合併皮膚筋炎症例などではマクロファージの活性化が示唆されたが、マクロファージは炎症組織に局在しており直接的にインフラマソームの活性化を示すことは困難だった。これら疾患はステロイドや免疫抑制剤に抵抗性の症例があり、インフラマソーム活性化を抑制する必要がある。しかしマクロファージのインフラマソーム活性化を選択的に阻害する方法は現状ではほとんどなく、その制御機構を明らかにする必要がある。
NLRP3の免疫沈降を複数の抗体で行ったが、インフラマソーム複合体形成を阻害せずにNLRP3を沈降できる抗体がなく、NLRP3の沈降でNLRP3インフラマソーム複合体を精製することは困難であった。NLRP3にタグをつけたプラスミドをTHP-1細胞株に遺伝子導入したが、蛋白の恒常的発現がえられなかった。従ってNLRP3を定常状態で沈降してきた際に共沈する分子について現在解析をすすめているところである。また他のインフラマソーム構成因子であるASC、caspase-1による免疫沈降でインフラマソーム複合体を精製する必要がある。最近ではNLRP3以外のNLRC4やNLRP1インフラマソームの病態形成への関与が明らかになってきており、これらの複合体の解析も必要と考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１．インフラマソーム抑制因子の同定：THP-1マクロファージでインフラマソーム構成因子の免疫沈降を無刺激およびリガンド刺激後で行い、質量分析法でインフラマソーム関連分子を探索する。得られた分子をTHP-1細胞株でshRNA法によりknockdownし、抑制因子を同定する。
２．インフラマソーム阻害剤の探索：インフラマソームの活性化を抑制する化合物について、化合物ライブラリーを用いてスクリーニングを行う。スクリーニングで効果が得られたものについて、細胞毒性がないことを確認した後にその作用機序を解析する。
３．インフラマソーム活性化の他の細胞への影響の検討：インフラマソームが活性化したマクロファージが周囲の細胞に与える影響について検討を行う。インフラマソームリガンドで刺激をしたマクロファージと形質細胞様樹状細胞、骨髄系樹状細胞、線維芽細胞、滑膜細胞をそれぞれ共培養する。樹状細胞ではサイトカイン産生をLuminexとIFN-α ELISA kitで測定し、線維芽細胞と滑膜細胞では細胞増殖とサイトカイン産生(Luminex)、膠原線維の産生を評価する。中和抗体でIL-1βとIL-18のシグナルを阻害した条件でも同様の実験を行う。
４．疾患での解析：RAおよびベーチェット病において、末梢血単球のどの分画（classical, intermediate, non-classical）がIL-1β産生に関与しているかを明らかにし、その分画の病態形成における役割を解析する。
|
