2016 Fiscal Year Research-status Report
難治がん克服を目指したNKp44-キメラ型受容体と新規NK細胞増幅法の開発
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16K10015
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
今井 千速 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90419284)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | キメラ抗原受容体 / 難治がん / 白血病 / 細胞療法 / 遺伝子改変リンパ球 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NKp44の特異性を用いたキメラ抗原受容体（CAR）遺伝子を複数作成した。K562-mb15-41BBLにより増幅培養したヒト活性化NK細胞からNKp44 cDNAをクローニングし、CD8などのT細胞に発現する膜受容体分子の各ドメインと組み合わせて、様々なデザインのCARを作成した。また、発現量はT細胞とNK細胞で異なる可能性があり、両者でそれぞれ検討した。
Jurkat-T細胞に前述の様々なNKp44-CARコンストラクトを遺伝子導入し、その発現パターンを確認した。NKp44-CARのヒト初代培養T細胞における機能評価では、ヒトprimary T細胞をIL-2存在下（200単位/ml）で抗CD3/抗CD28ビーズにより刺激し、レトロネクチン（Takara）存在下に48-72時間後にレトロウイルス液に暴露することでCAR-T細胞を作成した。ヒト活性化NK細胞への遺伝子導入は、K562-mb15-41BBLを用いた増幅培養系を用いて行った。T細胞、NK細胞のいずれにおいても、高い効率で（通常70％以上）遺伝子導入を達成できた。
各種の腫瘍細胞株のNKp44-Lの発現の有無をフローサイトメトリーにより解析し、多くのがん細胞における発現を確認した。CAR-T細胞は、各種の腫瘍細胞株と共培養し、細胞障害活性、CD107aアッセイ、サイトカイン産生能、活性化能（CD69, CD25）を比較した。ドナー間の個人差が生じやすいことから、複数の健常ドナーリンパ球を用いた実験を基本とした。
NK細胞体外増幅条件の改良とNK細胞増幅を促進する因子の探索に向けて、培養液（主として無血清培地）の種類、サイトカインの種類、Feeder cell lineへの照射量、照射後のインキュベーション時間などを比較検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CAR遺伝子作成は計画通りか、むしろ予定よりも早く進んでいる。ただし、NK細胞培養系の新規開発はやや遅れ気味である。総合的に判断し、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画にしたがって進める。
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| Causes of Carryover |
購入のタイミングなどの事務的理由で若干予定額を下回った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初の研究計画通りに研究を遂行することで、およそ予定通りの支出額となる予定である。
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[Journal Article] Characterization of pediatric Philadelphia-negative B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia with kinase fusions in Japan.2016
Author(s)
Imamura T, Kiyokawa N, Kato M, Imai C, Okamoto Y, Yano M, Ohki K, Yamashita Y, Kodama Y, Saito A, Mori M, Ishimaru S, Deguchi T, Hashii Y, Shimomura Y, Hori T, Kato K, Goto H, Ogawa C, Koh K, Taki T, Manabe A, Sato A, Kikuta A, Adachi S, Horibe K, Ohara A, Watanabe A, Kawano Y, Ishii E, Shimada H.
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Journal Title
Blood Cancer J.
Volume: 6
Pages: e419
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Hematopoietic stem cell transplantation for pediatric mature B-cell acute lymphoblastic leukemia with non-L3 morphology and MLL-AF9 gene fusion: three case reports and review of the literature.2016
Author(s)
Sarashina T, Iwabuchi H, Miyagawa N, Sekimizu M, Yokosuka T, Fukuda K, Hamanoue S, Iwasaki F, Goto S, Shiomi M, Imai C, Goto H.
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Journal Title
Int J Hematol
Volume: 104
Pages: 139-143
DOI
Peer Reviewed
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