2017 Fiscal Year Research-status Report

メラノーマ患者の血液循環腫瘍由来RNAを用いた病勢モニタリング法の確立

Research Project

Project/Area Number	16K10150
Research Institution	Sapporo Medical University
Principal Investigator	宇原久札幌医科大学, 医学部, 教授 (40201355)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	芦田敦子信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (00596786) 奥山隆平信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (80292332)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	リキッドバイオプシー / メラノーマ / RNA / BRAF
Outline of Annual Research Achievements	2016年度は血漿中のRNAの抽出方法を確立するために、Plasma/Serum RNA Purification Maxi Kit（Norgen Biotek社）を用いて健常人血漿サンプルからRNAを抽出した。2例の健常人血漿サンプル2mlから50uLのRNA溶液を抽出した。抽出されたRNAは微量のため、分光光度計では測定不能で、蛍光測定法で定量した。微量のRNAから効率よくcDNAを合成するためにicDNA Synthesis Kitを用いて検討した。予備実験として、BRAFV600E変異を持つメラノーマ培養細胞A375とBRAF変異のないメラノーマ培養細胞mel2を用いた。培養細胞のRNAからiScriptを用いて、逆転写を行った。培養細胞のRNA溶液内のゲノムのコンタミネーションの有無を確認するため、同じプロトコールで反応させた両方のサンプルをdroplet digital PCRで定量したところ、酵素を含まないサンプルでもBRAFV600E変異DNAやBRAFwild DNAがそれぞれ微量に含まれており、その割合は転写酵素入りのcDNA合成されたサンプルと比較しRNA溶液中にゲノムDNAが含まれているものの、その量はごくわずかであることが示された。本年度は、メラノーマ患者に使えるCirculating markerとして、末梢血中のmRNA（Tyrosinase, MART-1, gp100, Tyrosinase related　protein:TRP)の定量解析を計画した。まず、5種類のメラノーマ培養細胞における上記mRNAの発現と検出感度について検討し、低濃度でもmRNAの定量が可能であることが確認できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 微量のRNAを抽出するための方法を確立し、その際のゲノムDNAは微量であることを確認した。また、健常人の血漿中に含まれるRNA量を計測した。さらに、Tyrosinase, MART-1, gp100, Tyrosinase related　protein:TRPのmRNAの定量解析をメラノーマ培養細胞で検証した。
Strategy for Future Research Activity	患者血漿サンプルの解析を行い、治療効果との関連性を見ていく。また正常人血漿のデータを取り、cut off値の設定を試みる予定である。
Causes of Carryover	平成29年2月に勤務先を信州大学から札幌医科大学に移動したため、研究体制が十分にととなわず実験の遂行が一時滞ったため次年度への繰り越しが発生した。現在研究体制が整ってきたため次年度は予定通り予算を執行する。