2016 Fiscal Year Research-status Report
グリオスタチンのシグナルカスケード制御による関節リウマチ治療への応用
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16K10913
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
小林 正明 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (20254287)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (70212462)
永谷 祐子 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (90291583)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 関節リウマチ / 滑膜細胞 / プロモーター / Sp１ / マトリックスメタロプロテアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
関節リウマチ(RA)治療は劇的に進歩し、発症早期からの抗リウマチ薬、生物学的製剤、低分子シグナル伝達阻害剤の導入により、治療は寛解をめざすものになった。しかし未だに薬剤耐性難治性患者や、炎症が鎮静化されたにも関わらず骨びらんの進行がみられる患者が存在する。我々は、RAの発症に、グリオスタチンが密接に関与していることを初めて見いだした。これまでの基礎研究成果に基づき、グリオスタチン遺伝子の発現から関節炎惹起活性の発現に至る諸相を阻害することにより、RA病勢を緩和する方法を確立することを最終目標としている。
グリオスタチンは、thymidine phosphorylase (TP) 酵素活性を有するが、この酵素活性のみからグリオスタチンのもつ多彩な生物学的作用を説明することはできない。多彩な生物学的作用とは血管新生作用、グリア細胞に対しては増殖阻害作用、 皮質ニューロンに対しては神経突起伸長および生存維持活性である。最近他施設より滑膜細胞からのTPによってCXCL10が誘導され、TPの骨破壊への関与も示唆される報告がなされた。
滑膜培養細胞では、TNFなどの炎症性サイトカインによってグリオスタチンが誘導される。グリオスタチンのプロモーター領域にはSp1結合部位が7か所あり、このSp1結合部位を阻害することで、TNFによるグリオスタチンの発現を制御することが可能となり、グリオスタチン発現制御の一端を解明できた。RA患者の関節液中グリオスタチン濃度は、おおよそ300ng/mlであるが、この濃度のグリオスタチンを滑膜細胞に作用させることによりmatrix metaloproteinases-1、3、9、13を誘導することから、グリオスタチンは関節破壊に関与する因子の一つと考えられる。
そこで本研究ではRA滑膜炎増悪の一翼を担っているグリオスタチン発現制御分子機構の解明を目標とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H28年度の目標として、1) luciferase assay及びChIP assayを用いてのグリオスタチンプロモーター解析、2) FLSs核内におけるSp1の測定を挙げた。関節リウマチ患者からの滑膜採取と滑膜培養細胞の初代培養から継代は順調であり、研究検体の入手は問題なく、実験を進める上で特に問題は生じなかった。
グリオスタチンプロモーター領域にはSp1結合部位が7か所とinterferon gamma の結合部位であるISRESとGASが存在した。ISRESとGAS についてはinterferon gammaによる刺激実験をおこなった。interferon gamma刺激により、グリオスタチン発現が誘導された。グリオスタチンの発現調節機構の検索のためluciferase assayが必要と考えられ、vector を構築した。このassay系を用いてSp1阻害剤であるmithramycin処理するとluciferase活性が有意に抑制されることを見いだし、グリオスタチン発現にはSp1が重要であると、確信をもって次の実験系に進むことができた。グリオスタチンプロモーターのdeletion vector の作製も順調にすすみ、特に最上流のSp1 結合部位がGLS発現に非常に重要であることがわかり、これをクロマチン免疫沈降(ChIP)assayにて証明できた。活性化Sp1は核内移行することから、GLS発現のさいのSp1核内移行をSp1 western blotにて確認する予定であったが、これは28年度中には実現することができず、29年度の目標とする。
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| Strategy for Future Research Activity |
滑膜細胞では、TNFαによってGLSが誘導されるが、その機序は明らかにされていない。TNFαによって細胞質内あるいは核内のSp1の発現に変化がおこるかWestern blotにて明らかにする。
滑膜細胞でのGLS 産生はTNF-αによって誘導されることから、nuclear factor-κB (NF-κB)やmitogen-activated protein kinase (MAPK)シグナルの関与も示唆される。NF-κB阻害剤（SN50、MG132）、MAPKシグナルのextracellular signal-regulated kinase1 and 2阻害剤(PD98059)、c-jun N-terminal kinase阻害剤(SP600125)、p38 MAPK阻害剤(SB203580、SB202190)、蛋白合成阻害剤であるcycloheximideを使用してpretreatment後にTNF-α刺激を行い、GLS産生が抑制されるかを検討する。
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| Causes of Carryover |
２８年度の研究実績を英語論文として発表予定であったが、論文作成が遅れ次年度に持ち越した。そのため英文校正費と投稿費用分を次年度に持ち越した。また各種シグナル伝達阻害剤について研究協力者からの供与あったため相当額が次年度持ち越しとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２９年度６月マドリードにおいて国際学会(EULAR 2017)にてThe inhibitory effects of tacrolimus on gliostatin production in RA synoviocytesの演題が採択されたので、旅費として算定する予定である。また投稿をopen accessとするための費用として使用を計画している。
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[Journal Article] Do Mesenchymal Stem Cells Derived From Atypical Lipomatous Tumors Have Greater Differentiation Potency Than Cells From Normal Adipose Tissues?2017
Author(s)
Inatani H, Yamamoto N, Hayashi K, Kimura H, Takeuchi A, Miwa S, Higuchi T, Abe K, Taniguchi Y, Yamada S, Asai K, Otsuka T, Tsuchiya H.
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Journal Title
Clin Orthop Relat Res
Volume: 475
Pages: 1693-1701
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Sp1 inhibitor modulates the autocrine action of gliostatin/thymidine phosphorylase (GLS/TYMP) in rheumatoid fibroblast-like synoviocytes.2016
Author(s)
Tatematsu N, Waguri-Nagaya Y, Kawaguchi Y, Ikuta K, Kobayashi M, Goto H, Nozaki M, Aoyama M, Asai K, Otsuka T.
Organizer
Annual European Congress of Rheumatology (EULAR2016)
Place of Presentation
ExCel London, London (United Kingdom)
Year and Date
2016-06-08 – 2016-06-11
Int'l Joint Research
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[Presentation] Sp1 interference prevents joint destruction of RA through inhibitory effects of gliostatin and matrix metalloproteinase-3.2016
Author(s)
Ikuta K, Kawaguchi Y, Waguri-Nagaya Y, Tatematsu N, Kobayashi M, Goto H, Nozaki M, Aoyama M, Asai K, Otsuka T.
Organizer
Annual European Congress of Rheumatology (EULAR2016)
Place of Presentation
ExCel London, London (United Kingdom)
Year and Date
2016-06-08 – 2016-06-11
Int'l Joint Research
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[Presentation] The JAK inhibitor (Tofacitinib) inhibits TNF-induced gliostatin/thymidine phosphorylase expression in human fibroblast-like synoviocytes.2016
Author(s)
Kawaguchi Y, Waguri-Nagaya Y, Tatematsu N, Kobayashi M, Goto H, Nozaki M, Ikuta K, Aoyama M, Asai K, Otsuka T.
Organizer
Annual European Congress of Rheumatology (EULAR2016)
Place of Presentation
ExCel London, London (United Kingdom)
Year and Date
2016-06-08 – 2016-06-11
Int'l Joint Research
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[Presentation] Anterolateral ligament controls rotational instability as a secondary restraint in ACL deficient knee2016
Author(s)
Yasuma S, Nozaki M, Murase A, Kobayashi M, Sakai H, Goto H, Mitsui H, Nagaya Y, Iguchi H, Otsuka T
Organizer
17th ESSKA Congress
Place of Presentation
Centre Convencions Internacional Barcelona, Barcelona (Spain)
Year and Date
2016-05-04 – 2016-05-07
Int'l Joint Research
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