男性不妊症由来iPS細胞のエピゲノム解析および幹細胞研究による男性不妊症の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11072
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 小林 秀行 東邦大学, 医学部, 准教授 (10408875)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: iPS / 男性不妊症 / 無精子症 / AZF

Outline of Annual Research Achievements

男性不妊症は、約80％が造精機能障害であり、原因不明である。特に、無精子症は精液中に1匹もみられず、挙児を希望するカップルでは問題となる。無精子症の中でも非閉塞性無精子症は、精巣内で精子を全く作っていないか、もしくはごくわずかしか形成されていない重篤な病態である。
無精子症を呈する非閉塞性無精子症や閉塞性無精子症の精巣組織をmicro TESEやsimple TESEにて採取した。その後、線維芽細胞を樹立し、センダイウイルスを用いて、ヒトOct4, Klf4, Sox2, c-Mycを導入し、iPS細胞を誘導してきた。これまでに、47, XXYにて無精子症である、Klinefelter症候群由来iPS細胞の樹立に成功している。 (Shimizu T, Kobayashi H. 2016)また、ヒトの代替え種であるマイクロミニブタを用いたiPS細胞の誘導を試みたが、完全なiPS細胞を樹立することができなかった。(Yamabe F, Kobayashi H. 2017)
更なる検討として、男性不妊症患者から誘導したiPS細胞を用いて、網羅的な遺伝子解析を行なうことを予定していた。しかし、解析に必要な十分なiPS細胞を誘導することができず、研究の進行具合いに関しては、目標通りには進んでいない。今年は、①男性不妊症患者のiPS細胞の更なる誘導②樹立したiPS細胞の遺伝子の網羅的解析の2点を目指して研究を行なっていきたいと考えている。進行が遅れた原因としては、1年前（2016年12月末）に起こった-80℃冷凍庫の故障による保存検体の消失が影響していると思われる。保存していた線維芽細胞を失ったことにより、容易にiPS細胞の誘導が行なうことができず、新たに検体の採集に時間がかかっているためである。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

1年前（2016年12月末）に起こった-80℃冷凍庫の故障により、それまでに保存していた、約40の保存検体が消失した影響が、当該年度の研究の遅延につながっている。平成29年度の研究目標において、検体の収集を目標に掲げていたが、無精子症で施行するmicro TESEの件数が少なく、目標としていた検体数が集まっていない。そのため、次年度もまずは、研究に必要な検体収集を目標に研究を行なっていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度に目標とする検体数が集まっていない。そのため、男性不妊症患者から誘導したiPS細胞の網羅的な遺伝子解析が進んでいない。そのため、研究計画の変更あるいは研究を遂行する上での課題として、これまでに行なっていたマイクロミニブタでのiPS細胞のさらなる解析も検討している。また、男性不妊症患者の中でも、Y染色体上に存在するAZF遺伝子の欠損によるものがあり、臨床的にAZF欠失に関して調べることができる。これまでに、日本人におけるAZF欠失でのiPS細胞の報告はないため、AZF欠失における男性不妊症患者のiPS細胞の誘導の研究も検討している。

Causes of Carryover

検体収集を行なっており、予定している研究が行なえていない状況にて次年度使用額が生じている。使用計画については、iPS細胞を誘導するのに必要なキットや各種の培養液を購入する。具体的には、iPS細胞の作製および培養に必要な、ゼンダイウィルスのベクターキット、培養液、凍結液、剥離液を購入する。またiPS細胞を培養するためのフィーダー細胞である、MEF細胞を購入する。また、誘導したiPS細胞の解析に、外注検査として、染色体検査（Gバンド法）や、ゲノムシーケンスを予定する。