Optimization of whole genome amplification methods for single cell analysis

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K11106
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 佐藤 卓 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (40383898)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 全ゲノム増幅技術 / 着床前遺伝子診断

Outline of Annual Research Achievements

単一細胞・稀少細胞における遺伝子診断のために, 各種の遺伝子増幅法を, 検査の目的・解析法に応じて適切に選択することおよびその反応条件の最適化の検討を研究の目的として, 各種の解析を行った. 特に, 家系内に重篤な遺伝病を有するカップルが, 疾患を次世代に引き継ぐ事を予防する目的で実施される着床前遺伝子診断 (PGT) において, 簡便・安価な診断系構築を最大も目的とした.
遺伝子増幅穂として, 現在までに利用可能な全ゲノム増幅技術 (whole genome amplification: WGA)のうち, 特にPCR法を基本技術とするWGA (特にDOPlify)と, PCR法を基本技術としないMultiple displacement amplification法 (MDA)と, MDAとPCR法との複合的技術を原理とする各種WGA (特に, PicoPLEXとMALBAC)について, 増幅産物の持つ塩基長の比較, および調べたい遺伝子座およびその遺伝子変異や解析アプリケーション等に依存すると思われる検査のkanndo (特に変異の感度)について調べ, 比較検討した.
福山型ジストロフィー患者由来の株化リンパ球に対して, DNA抽出後にWGAを実施し, 福山型ジストロフィー患者のほぼすべてが持つSVAレトロトランスポゾンの挿入変異の検出の有無を調べた. かつ疾患を発症する患者の多くに関わる, 創始者効果としての罹患ハプロタイプを構成する, 責任遺伝子に近接する複数の遺伝子多型における感度およびアレルドロップアウトの率について調べた.
MDAによる増幅は, 調べたい遺伝子座における最終解析段階に置けるPCR産物の塩基長等に依らず, 安定的な増幅を占めした. 一方. CAリピートで構成されるShort tandem repeat: STR領域における遺伝子増幅では, PicoPLEXによる増幅で, 高い干出率を示した.