2018 Fiscal Year Research-status Report
ヒト胎盤分化成熟機構の解明：分化ステージの異なる細胞を分取し比較するアプローチ
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16K11118
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
石原 直恵 (琴村直恵) 藤田医科大学, 医学部, 研究員 (50571791)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原田 信広 藤田医科大学, 医学部, 教授 (00189705)
石原 悟 藤田医科大学, 医学部, 講師 (00300723)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 胎盤 / 栄養膜細胞 / 分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
栄養膜細胞は胎盤の主要構成細胞である。従って、栄養膜細胞のエストロゲン合成を伴う分化過程の解明は、胎盤の成熟、及び妊娠の維持に関する重要な知見をもたらすことが期待される。
ヒト栄養膜細胞のモデル細胞として知られるJEG3細胞株には、アロマターゼ(エストロゲン合成酵素)の陽性細胞と陰性細胞が混在しており、分化誘導処理により陽性細胞の割合が増加することを我々は確認している。これは、アロマターゼ遺伝子の発現を指標として分化ステージの異なる細胞を、JEG3細胞株集団から分取できる可能性を示している。そこで、CRISPR-Cas9を用いた相同組換えによるノックイン法で、JEG3細胞株のアロマターゼ遺伝子をGFP遺伝子に置換したレポーター細胞株の樹立を試みた。
組換えのドナーDNAには、GFP遺伝子及びピューロマイシン耐性遺伝子をアロマターゼ遺伝子の転写開始点前後に挟んだプラスミドを用いた。PCR法とサンガーシーケンス法により、得られたピューロマイシン耐性株の相同組換えを検定した。その結果、5´側は正しい組換えを確認できたが、3´側には余分な外来遺伝子を含むものが混在していた。原因として、アロマターゼ遺伝子中の反復配列の影響が考えられた。よって、耐性株をクローニングすることで、正しくノックインされたレポーター細胞株を得る操作を現在行っている。この細胞株の樹立により分化ステージの異なる細胞の分取が可能になり、発現遺伝子の細胞間比較から栄養膜細胞の分化に関連した因子が新たに同定されると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
CRISPR-Cas9法を用いたレポーター細胞株の樹立に想定外の時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
樹立したレポーター細胞株を分化誘導した後、セルソーターにかけGFP陽性細胞と陰性細胞を分取する。次世代シーケンサーを用いて両細胞集団間の遺伝子発現を比較することで、栄養膜細胞の分化に関連した新規因子の同定を試みる。
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| Causes of Carryover |
レポーター細胞株の樹立が遅れたため、その細胞株を用いた解析に要する経費が掛からなかった。
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