外有毛細胞シナプスにおけるグルタミン酸受容体の局在の同定と難聴発症機序の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11174
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 藤川 太郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60401402)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川島 慶之 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (10376759)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: デルタ受容体 / 高音障害型難聴 / 有毛細胞シナプス

Outline of Annual Research Achievements

本研究の主要な目的は興奮性神経伝達物質として神経系で普遍的に作用するグルタミン酸の受容体がシナプス可塑性と神経変性に重要な働きをしているグルタミン酸受容体のとくに外有毛細胞シナプスにおける局在を明らかにすることである。現在われわれはグルタミン酸受容体の中でデルタ受容体に注目している。デルタ受容体はAMPAなどその他のイオン透過型グルタミン酸受容体と構造の相同性がありながら単独では受容体機能は有さない。またサブタイプの一つであるデルタ１受容体（GluD1）はとくに小脳と内耳に強く発現し、GluD1ノックアウトマウスは高音障害型難聴を示すことが知られている。先行研究からデルタ受容体がCblnと共役してシナプスの安定化に寄与していることがわかっている。慶応義塾大学生理学教室との共同研究として、GluD1ノックアウトマウスの聴覚の表現型の解析とGluD1の有毛細胞シナプスにおける局在を解析中である。現在までに、Cbln1が外有毛細胞の遠心性シナプスに局在することが免疫染色によって判明した。生化学的な手法によりGluD1とCbln1が共役することがわかっているので、GluD1がCbln1と共役して外有毛細胞シナプスの安定化に寄与している可能性が十分考えられる。またラット、マウスの蝸牛の非脱灰標本を用いてTEM（透過型電子顕微鏡）画像を取得することにも成功した。これらの技術によって、GluD1の欠損がもたらす有毛細胞シナプスの形態学的変化を明らかにすることができると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

慶応義塾大学生理学教室との共同研究として発展し、GluD1ノックアウトマウスを用いた解析が可能となった。現在までに、ホールマウント蝸牛標本を用いた実験から、Cbln1が外有毛細胞の遠心性シナプスに局在することが判明した。また本学研究支援センターの市野瀬志津子先生の協力・指導のもと、マウスおよびラット蝸牛の非脱灰標本を用いてTEM（透過型電子顕微鏡）画像を得ることができた。現在は、シナプスに発現するたんぱく質がアルデヒド系の固定に非常に敏感でホールマウント染色によるアプローチは困難であるとの結論に至り、蝸牛の凍結標本から切片を作成して免疫染色を試みている状況である。

Strategy for Future Research Activity

当初はホールマウントによる免疫染色でアプローチしていたが、技術的な困難に遭遇したため、現在は蝸牛凍結標本の切片を用いた免疫染色を行う方針を切り替えて、検討をやり直している。ノックアウトマウスが十分な数に増えたら、ABR,DPOAEによる経時的な聴覚機能の変化と、騒音不可による変化を観察する予定である。また同じくノックアウトマウスを用いて非脱灰標本による蝸牛のTEMによってシナプスの構造的変化を詳細に調べる方針である。

Causes of Carryover

当初計画で必要としていた凍結置換法に必要な凍結置換装置が、共同研究のかたちに発展したことで、他大学が所有している同装置を利用できる見通しがたったため、購入する必要がなくなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

分与いただいたノックアウトマウスの表現型解析、構造解析のため、騒音発生装置やレーザーマイクロダイセクションをもちいたRNA発現解析など、必要な機器・試薬の購入にあてる予定である。また研究発表のため旅費として支出される可能性もある。