マウス双極細胞周辺受容野応答極性反転のメカニズム解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11333
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 尹 成珠 日本医科大学, 医学部, 助教 (30535430)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 網膜双極細胞 / NKCC1 / KCC2 / パッチクランプ法 / GABA受容体

Outline of Annual Research Achievements

網膜双極細胞は受容野の応答特性からON型とOFF型に分けることができる。ON型とOFF型で見られる受容野周辺部応答は同種類のGABA受容体を介して起こると考えられるため、どのようにして受容野周辺部応答極性を反転させているのか、そのメカニズムはまだ明らかになっていない。本研究は電気生理学的手法・分子生物学的手法を用いて、ON型とOFF型双極細胞のGABA受容体各サブタイプのイオン機構とCl－トランスポーターの分布パターンを再検討し、受容野周辺部応答極性反転の機構を明らかにしようというものである。
平成28年度,マウスの単離網膜双極細胞にホールセルーパッチクランプ法を適用し、Bathー application 法を用いてGABA応答を記録した。逆転電位を、細胞外液をHCO3－を含まないHEPESバッファー液と、HCO3－を含むHCO3－バッファー液の両方で測定し、この二つの溶液間でGABAAならびにGABAC受容体の逆転電位がHCO3－の有無に対してどのように変化するかを検討した。その結果、GABAAとGABAC受容体のHCO3－に対する透過性はほとんど変わりがないことが判明した。
免疫組織化学的手法を用いたGABA受容体サブタイプ並びにCl－トランスポーター分布の検討ではON型とOFF型双極細胞でCl－トランスポーターであるNKCC1とKCC2分布の違いが発現され、このようなCl－トランスポーター分布の違いがON型とOFF型双極細胞の受容野周辺部応答極性を反転に寄与している可能性が高いことを示唆している。
平成2９年度はCl－トランスポーター阻害剤であるBumetanide （NKCC1阻害剤）やVU0255011（KCC2阻害剤）を投与し、ON型とOFF型双極細胞でそれぞれどの程度の逆転電位の変化が見られるか検討する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウスの単離網膜双極細胞にホールセルーパッチクランプ法を適用し、Bathー application 法を用いてGABA応答を記録した。逆転電位を、細胞外液をHCO3－を含まないHEPESバッファー液と、HCO3－を含むHCO3－バッファー液の両方で測定し、この二つの溶液間でGABAAならびにGABAC受容体の逆転電位がHCO3－の有無に対してどのように変化するかを検討した。その結果、GABAAとGABAC受容体のHCO3－に対する透過性はほとんど変わりがないことが判明した。
免疫組織化学的手法を用いたGABA受容体サブタイプ並びにCl－トランスポーター分布の検討ではON型とOFF型双極細胞でCl－トランスポーターであるNKCC1とKCC2分布の違いが発現され、このようなCl－トランスポーター分布の違いがON型とOFF型双極細胞の受容野周辺部応答極性を反転に寄与している可能性が高いことを示唆している。

Strategy for Future Research Activity

平成２９年度はCl－トランスポーター阻害剤であるBumetanide （NKCC1阻害剤）やVU0255011（KCC2阻害剤）を投与し、ON型とOFF型双極細胞でそれぞれどの程度の逆転電位の変化が見られるか検討する予定である。
本来予定された各GABA受容体サブタイプ（GABAA、GABAC）の発現量をmRNAレベルで定量する実験は平成２８年度の実験結果からON型とOFF型双極細胞の受容野周辺部応答極性を反転に寄与しないことがわかり、中止することにする。
今後は電気生理学的手法と免疫染色、RT-PCRなどの研究方法を駆使し、ON型とOFF型双極細胞でのNKCC1とKCC2分布の違い、そして、その違いがON型とOFF型双極細胞の受容野周辺部応答極性を反転との関係を検討してみる予定である。

Causes of Carryover

電気生理学的手法と免疫染色、RT-PCR法などの研究方法を駆使し、ON型とOFF型双極細胞でのNKCC1とKCC2分布の違い、そして、その違いがON型とOFF型双極細胞の受容野周辺部応答極性を反転との関係を検討したところ、実験は予定とおり順調に進み、当分の間薬品購入の必要がなかったため、また出張を予定していた学会が大学での業務と重なって行けなくなったことから次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

Cl－トランスポーター阻害剤であるBumetanide （NKCC1阻害剤）やVU0255011（KCC2阻害剤）を投与し、ON型とOFF型双極細胞でそれぞれどの程度の逆転電位の変化が見られるか検討する。
更にNKCC1とKCC2の抗体を使った免疫染色法でON型とOFF型双極細胞でのNKCC1とKCC2の発現レベルを調べる。
また、NKCC1とKCC2の発現レベルをmulticell-RT PCR法で調べる予定である。このため、NKCC1とKCC2のプライマーの購入が必要であり、更に確実にON型とOFF型双極細胞を区分するために、ON型双極細胞だけに発現するｍGluR６のプライマーも当時に購入する必要がある。以上のプライマーをもって細胞レベルでのNKCC1とKCC2の発現レベルを調べONとOFF双極細胞での比較を行う予定である。