2016 Fiscal Year Research-status Report
ヒト神経芽腫におけるDFATを用いた新規神経分化誘導療法の検討
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16K11355
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
金田 英秀 日本大学, 医学部, 助手 (30598967)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古屋 武史 日本大学, 医学部, 助教 (20568539)
藤原 恭子 日本大学, 医学部, 助教 (40595708)
越永 從道 日本大学, 医学部, 教授 (70205376)
植草 省太 日本大学, 医学部, 研究員 (70746338)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | RET / Transglutaminase 2 / 分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、手術時に脂肪組織から得られた脱分化脂肪細胞（Dedifferentiated fat cells: DFAT）を調整・継代培養し、長期保存可能とした。さらに、ヒト神経芽腫細胞株とDFATを共培養し、神経芽腫細胞の形態変化と分化の有無を検討した。
ヒト神経芽腫細胞株（NB1、NB9、Kelly、NB69、SK-N-SH、SK-N-AS、SH-SY5Y）のうちNB9とSK-N-SHで、DFATと共培養72時間後に神経突起伸長促進の変化が認められた。72時間後の細胞を用いて、分化マーカーとしてTransglutaminase 2（TGM2）、Phox2bの発現をRNAレベルではReal-time RT-PCRで、蛋白レベルについてはWestern blottingで解析した。その結果、DFATとの共培養群でTGM2の発現が上昇し、Phox2bの発現が低下した。
また、DFATとの共培養72時間後に、神経芽腫細胞株の神経栄養因子受容体RET、TrkA、TrkBの発現をReal-time RT-PCRおよびWestern blottingで解析した。その結果、TrkA、TrkBは有意ではなかったが、NB9とSK-N-SHの両者でRETの有意な発現亢進を認めた。DFATとの共培養における増殖能の変化をWst-8で解析した結果では、共培養72時間まででNB9とSK-N-SHで有意な変化は認めなかった。さらに、NB9、SK-N-SHを使用し、DFATと共培養により腫瘍細胞が浸潤能・遊走能に影響を与えるか否かを検討した結果、有意な変化は認めなかった。細胞形態および分化マーカーの変化についてはRETを介したシグナル伝達が関係している可能性が考えられる。今後RETの下流シグナルの解析を行い、RETの発現亢進に関連するDFATの液性因子のついてさらなる検討を継続していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
脂肪組織から得られた脱分化脂肪細胞（Dedifferentiated fat cells: DFAT）の安定した長期培養・継代が可能となっており、ヒト神経芽腫細胞株との共培養で変化の認められた細胞株が絞りこまれた。絞り込まれた細胞株を使用し、DFATは液性因子を介して神経芽腫細胞株を分化誘導する可能性が示唆された。そのメカニズムには神経栄養因子受容体のRETが関与していると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト神経芽腫細胞株とDFATとの共培養による分化誘導機構について、RET発現抑制下でのDFATとの共培養による細胞形態の変化や分化マーカーの変化を解析していない。今後RETの発現を抑制し、NB9、SK-N-SHとDFATを共培養して分化誘導の有無を検討していく。また、DFATがRETの発現を亢進する機序について、DFATの培養上清に含まれる液性因子を解析する。DFAT、ASC、MSCを0.5%FBS含有DMEM培地で培養し、72時間後の培養上清を回収してサイトカイン定量抗体アレイを用いて解析する。
同定された液性因子の投与でRet下流のpathwayに関わるRAS、ERKなどの発現状態をRNAレベルではReal-time RT-PCRで、蛋白レベルについてはWestern blottingで解析する。これらのIn vitroの結果をもとにDFATの分泌する液性に含まれる分化誘導因子を同定する。In vitroで効果を認めた細胞株を用いて腫瘍モデルマウスを作製し、in vivoでDFAT投与による抗腫瘍効果を検討する。
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Research Products
(1 results)
