2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K11455
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| Research Institution | Kyushu Dental College |
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Principal Investigator |
豊野 孝 九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (10311929)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中富 満城 九州歯科大学, 歯学部, 講師 (10571771)
片岡 真司 九州歯科大学, 歯学部, 助教 (80364149)
瀬田 祐司 九州歯科大学, 歯学部, 教授 (90291616)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 味覚受容体 / 転写調節 / うま味 / アミノ酸 / T1R1 / T1R3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
うま味はT1R1およびT1R3により受容される。うま味受容体T1R1は、味蕾においてうま味の受容に関与しているが、うま味以外にもアミノ酸を受容すること、および味蕾以外の器官においても発現していることが明らかになっている。そこで本研究では、T1R1遺伝子を発現している筋芽細胞株C2C12を用いて、うま味受容体T1R1遺伝子の転写制御機構の解析を行った。これまでの解析の結果、マウスT1R1遺伝子の上流領域にあるGT-boxが転写の活性化に関与していることが明らかになった。そこで、GT-boxを含むDNA配列への結合タンパク質の同定を、タマビジンを使用したDNA アフィニティ沈降法(DAPA法)により試みた。
C2C12から抽出した核タンパク質を、ビオチン標識したGT-boxを含むDNA配列と反応させた。このDNA配列とタンパク質の複合体を、タマビジン標識磁性ビーズに結合させ、磁力によりDNA-タンパク質複合体を回収した。次に複合体に含まれるタンパク質の解析を、電気泳動法により行った。その結果、60kDaのタンパク質を同定した。次にそのバンドをゲルから切り出した後、トリプシンで処理を行った。切断されたペプチドフラグメントの質量をMALDITOF-MS （matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight mass spectrometer）法で測定し、これを 配列データベースMascot で検索することによりタンパク質を同定した。検索の結果、60kDaのタンパク質は転写因子Tbx3であることが明らかになった。
Tbx3はヒトをはじめとする多くの真核生物の発生に必須の転写因子であるが、うま味(アミノ酸)受容体T1R1との関係は明らかになっていない。そこで今後は、T1R1遺伝子の転写調節におけるTbx3の機能解析を行っていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではマウスT1R1遺伝子の転写調節機構の解明を目的として行った。その第一段階として、マウスT1R1遺伝子の転写活性化配列の同定、およびその配列に結合する転写因子の同定を行った。
レポーターアッセイ法により、開始コドン流-148bp ~ -91bpに転写活性化配列が存在することが明らかになった。次に過剰発現実験および、RNAi法により転写活性化配列中に存在するGT-boxにKLF2が結合し、転写の活性化に関与していることが推察された。さらに、GT-boxを含むDNA配列への結合タンパク質の同定を、タマビジンを使用したDNA アフィニティ沈降法(DAPA法)により試みた。その結果、転写因子Tbx3がGT-boxを含むDNA配列に結合することが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNA アフィニティ沈降法(DAPA法)により、GT-boxを含むDNA配列に転写因子Tbx3が結合することが明らかになった。そこで今後は、T1R1遺伝子の転写調節におけるTbx3の機能解析を以下の内容で調べていく予定である。(1) RNAi法によりTbx3遺伝子の発現阻害を行った場合のT1R1遺伝子の転写への影響。(2)Tbx3遺伝子を過剰発現させた場合のT1R1遺伝子の転写への影響。(3)クロマチン免疫沈降法による、転写因子Tbx3のT1R1遺伝子の上流領域への結合の確認。
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| Causes of Carryover |
マウスT1R1遺伝子の 転写調節機構の解析において、DNA アフィニティ沈降法(DAPA法)によるGT-boxを含むDNA配列に結合するタンパク質の同定に、予定より大幅に時間がかかった。そのために、その次に実施する予定であった解析の為の試薬の購入を延期したために、未使用額が生じた。
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