2017 Fiscal Year Research-status Report

Arl4cを標的とした核酸医薬による口腔がんの新規分子標的治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	16K11501
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	藤井慎介九州大学, 歯学研究院, 助教 (60452786)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	Arl4c / 口腔癌 / MEK/MAPK
Outline of Annual Research Achievements	本研究ではArl4cの扁平上皮癌をはじめとする口腔癌の腫瘍形成における役割とArl4cを標的とした口腔癌の新規分子標的治療法の確立を目的としている。平成29年度は以下の研究結果を得た。 ①3種類の口腔扁平上皮癌細胞株においてArl4cが高発現していた。また、これらの細胞株において、Arl4cの発現はMEK/MAPKシグナルに依存していたが、その上流因子(EGFRやRAS等)には依存していなかった。②歯原性腫瘍においてArl4cが高発現していた。またその細胞株において、Arl4cの発現がMEK/MAPKシグナルに依存しており、その発現はこの細胞株の増殖能および運動能を制御することを見出した。そこで、この細胞株においてCRISPR/Cas9法を用いてArl4cをノックアウトしたところ、タンパクレベルで発現が消失していた。③Arl4cを高発現していた口腔扁平上皮癌の症例からDNAを抽出し、MEK/MAPKシグナル上流シグナル(EGFRやKRAS)、APC、β-カテニンおよびPIK3CAの遺伝子変異について検討した。④予後不良の口腔扁平上皮癌症例において、転移巣ではArl4c陽性腫瘍細胞数が増加すること、そしてArl4c発現腫瘍細胞ではDNAが脱メチル化状態であることを免疫組織学的に明らかにした。加えて、DNAの脱メチル化が口腔扁平上皮癌細胞株の遺伝子発現および運動能に与える影響について検討した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成29年度の研究結果から複数の口腔扁平上皮癌細胞株においてArl4cを高発現していることが明らかとなった。また、これらの細胞株においてArl4cの発現がMEK/MAPKシグナルに依存していた。口腔扁平上皮癌の発生機序は未だ明らかになっておらず、本研究結果からMEK/MAPKシグナルの異常活性化がこのメカニズムの一因である可能性が示唆された。加えて、Arl4cは歯原性腫瘍においても免疫組織学的に高発現しており、また、その細胞株において高発現していた。歯原性腫瘍の発生機序は不明であり、Arl4cを基盤としてそのメカニズムを明らかにすることができるだけでなく、Arl4cが治療の標的となりうることが示唆された。予後不良の口腔扁平上皮癌症例において、転移巣ではDNAの低メチル化に伴ってArl4c陽性腫瘍細胞数の頻度が増加することから、Arl4cとDNAの低メチル化を指標とする新規診断法へと応用できる可能性が示唆された。
Strategy for Future Research Activity	①ヒト口腔癌(扁平上皮癌：舌・歯肉・口蓋・頬粘膜等および歯原性腫瘍)病理症例におけるArl4c発現を免疫組織学的に検討する。また、その発現と臨床病理学的な相関、再発の有無、生存期間について100症例程度検討する。この結果、Arl4cが腫瘍早期診断マーカーまたはがん予後予測マーカーとなりうるか検討する。 ②網羅的に口腔扁平上皮癌細胞株および歯原性腫瘍細胞株におけるArl4cの発現機序、すなわち増殖因子シグナル(β-カテニンおよびMEK/MAPKシグナルおよびその上流シグナル)またはDNAメチル化について検討する。 ③Arl4cを高発現する口腔扁平上皮癌細胞株および歯原性腫瘍細胞株におけるArl4cの役割を明らかにする。具体的にはこれらの細胞株においてArl4cのノックダウンまたはCRISPR/Cas9法によるノックアウトによって増殖や運動能に与える影響について明らかにする。
Causes of Carryover	(理由) 本研究計画では舌発癌モデル作製後、siRNAを用いてArl4cを発現抑制し、抗腫瘍効果について検討することを目的とする。平成29年度に所属施設の動物実験室にて感染事象が発生し、動物実験が行えなかった。このため動物実験用に計上していた使用額を次年度へ繰り越した。 (使用計画）所属施設動物実験室が再開された際は舌発癌モデルを作製する。また、Arl4cを高発現する腫瘍標本からDNAまたはmRNAを抽出し、増殖因子シグナルが活性化しているかおよび活性化する遺伝子(EGFR,RASおよびRaf等)の変異について検討する。