2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞外核酸, ナノファイバー, シャペロンによる病原性バイオフィルム形成の検討
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16K11537
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
泉福 英信 国立感染症研究所, 細菌第一部, 室長 (20250186)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中尾 龍馬 国立感染症研究所, 細菌第一部, 主任研究官 (10370959)
成澤 直規 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (90632034)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | バイオフィルム / eDNA / 蛋白質 / Streptocpccus mutans / Staphylococcus aureus / ナノファイバー / シャペロン / クオラムセンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高齢化と共に、歯周病, 日和見菌感染症, 口腔粘膜疾患, 感染性心内膜炎, 誤嚥性肺炎などの疾患になりやすい人が増えている. しかしこれらの疾患に関わる病原性口腔バイオフィルム(BF)形成メカニズムは詳細に明らかになっていない。口腔常在菌よりも病原性が高まったStaphylococcus aureusなどの日和見菌とStreptococcus mutansなどの口腔常在菌との複合菌BF形成メカニズムを明らかにすることを目的にする。近年BF形成に関わる事が明らかになったeDNA, eRNA, ナノファイバー, シャペロンの混合BF形成への役割を明らかにすることも併せて目的にする. S. mutans UA159とすでに作製されたS. mutans UA159Com依存遺伝子変異株（comC, comD, comE, comX, comR, comS, ｃomYA）の変異株やLuxS依存遺伝子群（luxS, luxR）の変異株を用いてS. aureusとの混合菌BF形成実験をヒト唾液コート96穴マイクロタイタープレートを用いて行った。その結果、混合菌BF形成量は、Com変異株群やLuxS変異群で親株UA159よりも減少することが明らかとなった。これらの結果は、ComやLuxSのようなクオラムセンシングに関わるシステムが混合菌BF形成に関与している事を示している。S. mutansから粗抽出DNAと精製DNAを抽出し、それらを非水溶性グルカン合成能を欠落したS. mutans UA159.gtfBC-変異株に加えバイオフィルム形成量を検討すると、粗抽出DNAが精製DNAよりもBF形成を誘導することが明らかとなった。この粗抽出DNAには、蛋白質が多く含まれていた。この蛋白質とDNAの存在がグルカンに依存しないBF形成に重要であることも明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
口腔常在菌であるS. mutansと日和見菌であるS. aureusとの混合菌バイオフィルム形成が成功したこと、またこの混合菌バイオフィルム形成にはcom依存およびluxS依存クオラムセンシングが関与していることが明らかになったこと。さらに粗抽出DNAがS. mutansのバイオフィルム形成能を欠落したS. mutans UA159.gtfBC-変異株のバイオフィルム形成を誘導したこと。その誘導に蛋白質が関与していることが明らかになったことなどから当初の計画よりも一歩進んだ成果を得ることができた。当初の計画以上に進展していると評価するところだが、本年度計画していたYidC1およびYidC2の変異株の作製の作製とナノファイバー観察が遅れていることもあり、おおむね順調に進展しているという評価をした。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずYidC1およびYidC2の変異株の作製の作製を行い他の変異株と共にナノファイバー観察を行う。
作製されたS. mutans変異株を利用して, 単独あるいは複合微生物（S. aureusおよび C. albicansを含む）のバイオフィルム形成実験をフローセルシステムおよびNOD/SCID.e2f1-/-マウスを用いて行う.
１）フローセルを用いたバイオフィルム形成実験
ヒト唾液をセルにコートしPBSにて洗浄後, 作製した変異株や親株などを単独接種ならびにS. aureusやC. albicansとの混合菌接種をセル表面へ行う.バイオフィルム形成の評価は, LIVE/DEAD® BacLightTM Viability Kitで染色し共焦点レーザー顕微鏡を用いたCOMSTAT解析により蛍光強度を定量的に検討する。 DNaseやRNaseを処理し, バイオフィルム量の変化を上述の方法にて測定する.シャペロンの観察は, 電子顕微鏡および標識YidC1抗体やYidC2抗体などで免疫染色し検討を行う.
2) マウスモデルを用いたバイオフィルム形成実験
0.2%クロルヘキシジンや抗生物質でマウス口腔を一時的に無菌化しPBSにて洗浄後, 滅菌した唾液を処理しPBSにて洗浄, S. mutans変異株とS. aureusやC. albicansを混合し口腔に接種する。eDNA, ナノファイバー, シャペロン産生が上昇あるいは下降した変異株とS. aureusやC. albicansを混ぜた時に, 親株と比較してバイオフィルム内のS. aureusやC. albicansの菌量の増減やバイオフィルム形成量を観察する.
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| Causes of Carryover |
3月末に行った国際学会および国内学会、英文校閲等の支払いが、事務手続きの関係上支払いが間に合わなくなり、次年度支払いになったため。一部の消耗品が海外生産で届くのが遅くなってしまい、消耗品の支払いが次年度に回ってしまったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額に関して４月～５月の半ばまでに使用を終了する予定である。平成29年度分は、４月から来年３月にかけて、細胞培養の消耗品、動物実験の消耗品、菌の培養の消耗品等に使用し、論文発表の掲載料、英文校閲料、国内外発表の旅費、学会参加費等に使用し、３月末までに使い切る予定である。
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