歯髄細胞の幹細胞化を応用した新規治療法の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K11600
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 宮城 麻友 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (20625719)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 美穂 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (20271059) ; 松香 芳三 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 教授 (90243477) ; 大野 充昭 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (60613156)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: TNF-α / 歯髄細胞

Outline of Annual Research Achievements

歯髄細胞に対するTNF-αのリプログラミング効果（幹細胞化）の作用メカニズムを解明し，歯髄細胞のリプログラミングに関与している因子を同定することを目的としている．
実験に同意の得られた患者から提供を受けた抜去歯牙の歯髄から，Gronthosらの方法に準じて歯髄細胞の分離・培養を行い，冷凍保存することで後の実験に備えた．
歯髄細胞にTNF-αの刺激が加わった際に誘導されるシグナル経路を明らかにするため，前年度に行った抗体アレイ法を用いた解析を再度行った．これは検出が不安定だった因子の種類を再確認する為である．TNF-αのシグナル経路に関与する因子のうち前回採用したものと同じものを45種類選択・配置したメンブレンを作製した．その後，TNF-α（10ng/ml）を添加し2日間刺激した歯髄細胞と無処理の歯髄細胞からそれぞれタンパク質を回収し，抗体アレイ実験を行った．前年度と同じ方法を採用し，サンプル溶液中にメンブレンを浸してインキュベート，メンブレン洗浄後に，酵素標識抗体ミックスとインキュベートし，洗浄後，酵素反応 （化学発光） させることでタンパク質の検出を行った．TNF-αにより刺激した歯髄細胞から得られたタンパク質から，p38MAPK，TRAF1，Caspase3，SODD，RIP，TNFR1，JNK1,2,3，IκB-αが検出された．
それぞれの因子について，論文検索を行い，促進剤・阻害剤について検討を行った．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度に行った抗体アレイ法を用いたシグナル経路の検討が不安定な結果であったため，実験条件の調整に時間を費やし，再度同様の実験を行ったため当初予定していた段階からは遅れを取ったと考える。しかし，その後検出されたそれぞれの因子について，論文検索を行ない，促進剤・阻害剤について検討を行ったり，今後の実験方法について検索することができた．

Strategy for Future Research Activity

TNF-αにより刺激した歯髄細胞から得られたタンパク質から，前年度と同様にp38MAPK，TRAF1，Caspase3，SODD，RIP，TNFR1，JNK1,2,3，IκB-α
が検出された．
今後の推進方策としては，まず，Western blotting法を用いて各因子の発現の増減を確認する．また，細胞のリプログラミングの関与が予測されるシグナル経路に対して，そのシグナル経路促進剤，あるいは阻害剤を歯髄細胞に作用させ，実際にシグナル経路の制御が可能な因子を検討する．
加えて，マウス第一大臼歯を露髄させた露髄モデルを作成し，同定した因子をコラーゲンスポンジと混和して露髄部に移植，緊密に封鎖する．4,12,24週後にこれらの組織を回収し，修復象牙質が形成されているかを，形態学的（micro CT），組織学的（HE染色，免疫組織染色）に観察・検討したいと考えている．

Causes of Carryover

今年度内に購入・使用予定であった試薬などがすべて購入できていないため．
引き続き培養細胞を用いた分子生物学実験のために培養関連の試薬，消耗品およびリコンビナントタンパクを購入する．また，同定された因子の動物への効果を検討するため免疫不全マウスの購入も予定している．加えて国内の学会に参加して最新の知見を得るとともに積極的な成果発表を行うための旅費としても使用を予定している．