2016 Fiscal Year Research-status Report
Cas9変異体によるニックが起こす相同組換え修復様DNA組換えの分子機構の解明
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16K12596
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
中田 慎一郎 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (70548528)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / ニック |
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| Outline of Annual Research Achievements |
塩基置換に成功するとEGFPを発現する細胞株（報告者の研究室で作成した）を用いて、1塩基置換効率を測定する系を確立した。標的となる塩基に対して、上流のセンス鎖、アンチセンス鎖それぞれを標的とするgRNA、下流のセンス鎖（2カ所）、アンチセンス鎖（2カ所）それぞれを標的とするgRNAを作成した。Cas9D10Aを細胞に発現させることでレポーター遺伝子にニックを発生させた。gRNAを2種類組み合わせることにより、2つのニックから作られうるすべてのパターンのDNA損傷を発生させることが可能となった。ドナープラスミドとしては、上述の様に設計したgRNAのターゲットシーケンスに、様々なパターンでサイレント変異を挿入したものを多種用意した。これにより、2つのgRNAによりドナープラスミド上に、2箇所ニックが発生する、1箇所のみニックが発生する、ニックが全く発生しないというすべてのパターンを網羅できるようにした。これらの材料を用いて、ゲノム編集の効率を測定した。その結果、これまでの常識と異なり、DNA2本鎖切断を発生させない場合であっても、効率の高いゲノム編集が達成できることが示された。
上記の実験において、ドナープラスミド上のホモロジーアーム長はEGFP遺伝子長よりわずかに短い長さに設定した。DNA2本鎖切断を発生させずにゲノム編集を行う場合に必要とされるドナープラスミド上のホモロジーアーム長を明らかにするため、様々なホモロジー長を持つドナープラスミドを設計し、ゲノム編集実験を行った。その結果、ホモロジー長が長いほどに高効率にゲノム編集が行われることが明らかとなった。また、このとき、上流方向にも下流方向にも長いことが必要であることも明らかとなった。そして、実際にホモロジーアーム上のホモロジーシーケンスがゲノムに取り込まれたことを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目標としては、１．ゲノム編集効率測定のための試料を作りアッセイを完成させ、２．さらにDNA2本鎖切断を発生させずにゲノム編集を達成する条件を探索し、３．また、高効率にゲノム編集を達成するためにドナープラスミドに求められる条件を検討することであった。すべての目標を達成することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNA2本鎖損傷を発生させずにおこなうゲノム編集法で用いられているDNA修復経路を探索する。ドナープラスミド上のホモロジー長が長いほどにゲノム編集効率が高いことから、ゲノムとドナープラスミドとの間で相同組換えが行われている可能性が高いと予想される。そこで、CtIP、BRCA2やRAD51といった相同組換えに必須となる遺伝子の発現を抑制した細胞を用意し、これらの細胞におけるゲノム編集効率を測定する。実際に相同組換えが関与する場合、その過程のすべてが必要か、一部が必要かといった疑問点も上記の研究成果により解決されると期待できる。また、本ゲノム編集法に相同組換えが関与していた場合には、相同組換えを促進する薬剤や非相同末端結合の阻害薬により、より高い効率のゲノム編集が達成できるか検討を行う。
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| Causes of Carryover |
研究補助者を雇用し、研究を実施する予定であったが、適任者が見つからず、研究代表者がすべての実験を行ったため、人件費を使用しなかった。すでに研究室で構築していた研究材料をうまく応用利用することで、実験計画をスリム化することが可能となったため、予定通りの研究を実施することができた。また、これにより、消耗品の利用も少なくなったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
遺伝子ノックダウンを行うことにより、DNA修復経路の探索を行うためのsiRNAの合成や、トランスフェクション試薬などに利用する。さらに、本ゲノム編集法の安全性確認に備えるため、ゲノム編集を繰り返したり、ゲノム編集に成功した細胞クローンの樹立したりするための細胞培養等に費用がかかると考えている。また、今後は煩雑な実験が増えるため、なるべく早く研究補助者を雇用し、よりスピードアップして効率的な研究を行う。
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