2017 Fiscal Year Research-status Report
Cas9変異体によるニックが起こす相同組換え修復様DNA組換えの分子機構の解明
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16K12596
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
中田 慎一郎 大阪大学, 医学系研究科, 特命教授 (70548528)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 相同組換え / DNA修復 / Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
標的遺伝子に２カ所のニックを入れるタンデムニック法、そして、標的遺伝子に1カ所のニック、ドナープラスミドにも1カ所のニックを入れる方法（SNGD法）により、効率的かつ正確にゲノム編集が誘導できることを示した。４カ所あるいは１７カ所のサイレント変異を入れたドナープラスミドを用いた場合、ゲノム編集効率が著しく低下した。ホモロジーの正確性を要求するのは相同組換え修復の特徴であることから、ＳＮＧＤ法では相同組換え様のＤＮＡ修復経路が利用されていることが示されたと考えている。
ｓｉＲＮＡを用いて、ＣｔＩＰ、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１をノックダウンしたのち、ゲノム編集を実施した。古典的なＤＳＢ法では、ノックダウンしたすべての遺伝子に依存したゲノム編集が行われることが明らかとなった。標的遺伝子のみにニックを入れたゲノム編集の場合には、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１には依存するものの、ＣｔＩＰには依存しなかった。このことから、Ｃａｓ９変異体ニッカーゼによるニック部位では、ＤＮＡ ｅｎｄ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎがなくても、３′エンドの１本鎖ＤＮＡ鎖を露出できることが示された。ＳＮＧＤ法ではさらにＲＡＤ５１への依存性も認められなかった。このことから、ドナープラスミドにニックを入れることで、ゲノム上に発生した1本鎖ＤＮＡがドナーにインベイドしなくとも、アニールすることができるようになったと考えている。これらのデータから、ＳＮＧＤ法は未知の非古典的相同組換え修復様のＤＮＡ修復機構が用いられていることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定では、ニックによるゲノム編集法のＤＮＡ修復経路を明らかにする予定であった。研究実績の概要に記載したように、ニック法では、相同組換え修復の後半部分を、ＳＮＧＤ法では未知の非古典的相同組換え修復が機能していることを明らかにすることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ＳＮＧＤ法によるゲノム編集で用いられるＤＮＡ修復経路は、非古典的相同組換え修復である。この機構の全容解明することも重要ではある。しかしながら、細胞での通常の状態で機能するＤＮＡ修復ではないことを鑑みると、機能する遺伝子の探索の波及効果はそれほど大きいとは考えていない。（探索のためには、研究費の範囲内で収まらない大がかりな実験が必要だと予想されるため。）むしろ、ニックを配置部位の違いがゲノム編集効率に与える影響を解析する方が今後のゲノム編集技術の向上に有用であると考え、そのような観点から研究を実施する。
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| Causes of Carryover |
研究計画を順調に実施し、Cas9変異体によるニックが起こすDNA 組換えは、古典的な相同組換え修復ではなく、CtIP、RAD51非依存的な新しい相同組換え修復であることを発見した。この新しい修復の分子機構をより精密に明らかにするためには、プラスミドではないオリゴDNAドナーを用いたり、新たなレポーター細胞の利用する研究が有用であるため、期間を延長して研究を実施する必要があるため。
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Research Products
(5 results)
