2017 Fiscal Year Research-status Report
分子近接場振動分光法によるタンパク質局所ナノメートル構造ダイナミクス計測法開発
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16K13933
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
水野 操 大阪大学, 理学研究科, 助教 (10464257)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 分子近接場振動分光法 / ヘムタンパク質 / 対称中心 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、「分子近接場振動分光法」をもちいて、ヘムタンパク質の補欠分子族であるヘムに近接するナノメートル領域にある分子運動を観測する手段を確立することを目的とする。分子近接場効果は、対称中心を持つ分子における分子間相互作用を利用したハイパーラマン過程において観測される。ヘムタンパク質において、分子近接場振動スペクトルを観測するために、対称中心をもたないヘムから、対称中心を持つエチオヘム（D4h対称性）を補欠分子族として再構成したミオグロビンをもちいる。再構成ミオグロビンのエチオヘムの時間分解共鳴ラマン測定によるダイナミクス観測はすでに行われており、本研究の結果と直接比較することが可能である。このため、新規分光法確立のためには、最適な実験系であると言える。
平成29年度は、溶液状態での実験条件の再検討をはじめに行った。その理由として、平成28年度に確認していたエチオヘム溶液の共鳴ハイパーラマンスペクトルに観測される溶液分子に由来するハイパーラマンバンドが、分子間振電相互作用により観測されるものではなく、過剰なエネルギーをもつ励起光による溶媒分子のハイパーラマン散乱発生であったことが挙げられる。現在までに、高いシグナル検出を行うための分光システムの改良を行った。この結果、分子近接場振動スペクトルを観測するための実験システムが整備された。
実験にもちいるエチオヘムは、化学合成により得られるが、学内の他研究室と協力して、合成・精製方法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成29年度は、溶液状態のエチオヘムの共鳴ハイパーラマン散乱観測における実験条件の再検討が必要となった。この実験は、分子近接場振動分光法をもちいてタンパク質ダイナミクス計測を行うにあたり、鍵となる実験であるため、より慎重な条件検討が必須であると考えたからである。さらに、使用するレーザーシステムの劣化により、新たなレーザーシステムへの更新が行われた。その間、実験の中断期間があった。新たなレーザーシステムに対応し、高いシグナル検出を行うための分光システムの改良に想定外の時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は、エチオヘムで再構成したミオグロビンにおいて、タンパク質における時間分解分子近接場振動スペクトルを観測する。
①タンパク質中の共鳴ハイパーラマンバンドの帰属：変異体作製によるエチオヘム周辺のアミノ酸残基置換や重水素置換を行い、ネイティブな状態とのスペクトル比較を行い、観測されたハイパーラマンバンドがどのようなタンパク質構造を反映しているかを明らかにする。
②時間分解共鳴ハイパーラマン散乱測定：可視ピコ秒パルスを一酸化炭素（CO）結合形ミオグロビンに照射し、COの光解離にともなうスペクトル変化を見出す。スペクトル変化に現れる局所構造変化の部位は、①で行った帰属を基に考える。スペクトルの時間変化から、どれくらいの速度で、どのようにヘム近傍局所領域の構造変化が起こるのかを調べる。
③タンパク質ダイナミクスの新規計測手法の確立：時間分解共鳴ラマン分光法によるCO結合形ミオグロビンのCO光解離ダイナミクス観測は報告されており、本研究で得られた結果と比較・検証する。これにより、ヘムの光反応にともなうタンパク質ダイナミクスの新たな計測手法を確立する。
④新しいプローブの探索：分子近接場効果は、βカロテン溶液の共鳴ハイパーラマン散乱の観測により初めて報告された。βカロテンを補欠分子族にもつタンパク質について、エチオヘム再構成ミオグロビンと同様の実験研究を行う。
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| Causes of Carryover |
本研究における目的を達成するために、より詳細な追加実験の実施を行う。そのための、光学部品および試料作製のための原料購入に充てる。
研究計画にある新規計測法開発は進んでいるため、さらに得られた研究成果に対して、次年度に学会発表および論文執筆を行う。そのための旅費および論文校正費用に充てる。
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[Journal Article] Opn5L1 is a retinal receptor that behaves as a reverse and self-regenerating photoreceptor2018
Author(s)
Keita Sato, Takahiro Yamashita, Hideyo Ohuchi, Atsuko Takeuchi, Hitoshi Gotoh, Katsuhiko Ono, Misao Mizuno, Yasuhisa Mizutani, Sayuri Tomonari, Kazumi Sakai, Yasushi Imamoto, Akimori Wada and Yoshinori Shichida
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Journal Title
Nat. Commun.
Volume: 9
Pages: 1255
DOI
Peer Reviewed
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