2017 Fiscal Year Research-status Report
成熟視床下部における神経新生機構の解明：胚性幹細胞を用いたアプローチ
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16K14556
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
長崎 弘 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (30420384)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小谷 侑 藤田保健衛生大学, 医学部, 助教 (60644622)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 視床下部 / 神経新生 / 胚性幹細胞 / 神経幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年の研究から間脳視床下部領域において神経新生現象が見出され、摂食行動やエネルギー代謝を調節することが示唆されている。本研究ではマウス胚性幹細胞（ES細胞）から視床下部組織を分化誘導する培養系を用いて、in vitroで神経新生現象を再現し、その生理的な調節因子の解明を目的とする。
前年度までに、視床下部神経幹細胞マーカーであるRax遺伝子にGFPをノックインしたES細胞株（Rax::GFP株）を用いることで、分化誘導した視床下部組織においても一定数の神経幹細胞が維持されることを見出した。本年度は、これらのGFP陽性神経幹細胞がin vivoの神経幹細胞と同様の性質を有しているかどうかを検討した。成熟視床下部では、第三脳室の上衣細胞の一種であるタニサイトが神経幹細胞として機能すると考えられている。分化誘導した視床下部組織において免疫組織化学的解析を行った結果、Rax::GFP陽性細胞はタニサイトに発現が認められる各種幹細胞マーカーを発現しており、神経細胞やグリア細胞のマーカーはほとんど発現していないことを見出した。さらにRax::GFP陽性細胞はタニサイトに類似する細胞形態を示すことも分かった。
次に、これらのタニサイト様細胞の幹細胞活性を検討するため、チミジンアナログであるEdUを用いて分裂細胞を標識した。分化培養35日目から50日目にかけてEdU処理を行ったところ、Rax::GFP陽性細胞の数％程度がEdUで標識された。すなわち大部分のタニサイト様細胞は静止状態にあり、一部のみが増殖活性を持つことから、成熟脳における神経幹細胞の一般的特性を再現していると考えられる。さらにEdU陽性細胞の一部は神経細胞マーカーを発現していたことから、タニサイト様細胞は神経新生能を持つ可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでの研究から、ES細胞を用いた分化誘導系においても成熟視床下部に存在する神経幹細胞が再現されることを見出し、着実に進捗していると言える。一方でこれらの幹細胞が神経新生を生じ得るかどうかについては、未だ実験的証明はできていない。本年度はこの点を明らかにするために、Rax陽性幹細胞のGenetic lineage tracing（細胞系譜追跡）を行う予定であったが、これに必要なES細胞のゲノム編集に時間を要している。当初計画したゲノム編集の工程において細胞死が誘導されることが判明したため、ベクター類の再設計を行い、別の手順で現在作業を進めている。来年度中にゲノム編集が完了し、神経新生の解析を実施できる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
前述したゲノム編集が完了次第、神経新生の解析を実施する。フローサイトメトリーあるいはイメージング解析により新生細胞を定量化することで、種々の増殖因子や栄養シグナル分子（グルコース、レプチン、インスリンなど）が神経新生に及ぼす影響を定量的に評価する。また免疫組織化学的解析により、新生細胞がどのような視床下部ニューロンやグリア細胞種に分化しているかを評価する。さらに新生細胞の蛍光標識によりライブセル解析が可能になることから、細胞内カルシウムイメージングを行い、栄養シグナル分子への反応性などの機能的成熟度を評価する。
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| Causes of Carryover |
これまでの研究から、ES細胞を用いた分化誘導系においても成熟視床下部に存在する神経幹細胞が再現されることを見出し、着実に進捗していると言える。一方でこれらの幹細胞が神経新生を生じ得るかどうかについては、未だ実験的証明はできていない。本年度はこの点を明らかにするために、Rax陽性幹細胞のGenetic lineage tracing（細胞系譜追跡）を行う予定であったが、これに必要なES細胞のゲノム編集に時間を要している。当初計画したゲノム編集の工程において細胞死が誘導されることが判明したため、ベクター類の再設計を行い、別の手順で現在作業を進めている。来年度中にゲノム編集が完了し、神経新生の解析を実施する。フローサイトメトリーあるいはイメージング解析により新生細胞を定量化することで、種々の増殖因子や栄養シグナル分子（グルコース、レプチン、インスリンなど）が神経新生に及ぼす影響を定量的に評価する。また免疫組織化学的解析により、新生細胞がどのような視床下部ニューロンやグリア細胞種に分化しているかを評価する。さらに新生細胞の蛍光標識によりライブセル解析が可能になることから、細胞内カルシウムイメージングを行い、栄養シグナル分子への反応性などの機能的成熟度を評価する。
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