2017 Fiscal Year Research-status Report
植物ホウ酸チャネルのER exitを制御するカーゴレセプターの同定
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16K15082
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
高野 順平 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (70532472)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ホウ酸チャネル / 小胞体 / ゴルジ体 / カーゴレセプター / 分泌系 / 花粉 / シロイヌナズナ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、シロイヌナズナにおいてSPOT1/KNS3と呼ばれる機能未知タンパク質がホウ酸チャネルのカーゴレセプターとして小胞体から細胞膜への細胞内輸送の初期段階を制御することを証明することを目的としている。本研究の端緒は、GFPタグしたホウ酸チャネルGFP-NIP5;1が根の表皮細胞において小胞体にとどまる変異株を単離し、その原因遺伝子をSPOT1/KNS3と同定したことにある。SPOT1/KNS3の変異株は花粉の外壁構造に異常を持つことがすでに知られていたため、SPOT1/KNS3の膜タンパク質輸送機能は花粉の発達にも寄与すると考えられる。平成28年度までにspot1/kns3変異株の根の表皮細胞において様々な膜タンパク質の局在を解析したところ、ホウ酸チャネルのみが小胞体にとどまることが明らかになっていた。平成29年度はタバコ葉における一過的発現系を用いて細胞内局在解析を進め、SPOT1/KNS3は小胞体膜とゴルジ体膜に局在することを明らかにした。以上から、SPOT1/KNS3はホウ酸チャネル特異的に小胞体からゴルジ体への輸送を助けるカーゴレセプターである可能性が高まった。平成29年度には、NIP7;1-GFP発現形質転換シロイヌナズナを作出し、ホウ酸チャネルNIP7;1は葯のタペート細胞の細胞膜に局在することを示した。NIP7;1は葯室にホウ酸を供給して花粉の発達に貢献する可能性が高い。H30年度はspot1/kns3変異株のタペート細胞におけるNIP7;1の局在と、ホウ酸チャネルとSPOT1/KNS3の相互作用に焦点をあてて解析を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
SPOT1の細胞内局在解析を行うため、各種タグ付きのSPOT1/KNS3を発現する形質転換シロイヌナズナを作出しているが、タグSPOT1/KNS3が十分に発現しspot1/kns3変異株の表現系を機能相補する系統が得られていない。
SPOT1/KNS3とNIP5;1の間の相互作用をベンザミアタバコ葉への一過的発現系においてBiFC法で解析した。おそらくゴルジ体と考えられるコンパートメントでのBiFCが見られたが、同様の結果がNIP1;2についても見られた。したがって特異的な結合を示すことができていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
spot1/kns3変異株の表現系を機能相補するタグSPOT1/KNS3系統が得られていない問題については、発現ベクターにおけるタンパク質コード領域前後の配列を見直すことによって安定発現させて解決する。また、タバコ葉ではなくシロイヌナズナ変異株を用いた一過的発現によって機能相補を簡便に評価できるようにして解決する。
SPOT1/KNS3とNIP5;1の間の相互作用については、共免疫沈降法を中心に様々な手法によって検証する。
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| Causes of Carryover |
共免疫沈降など生化学実験に手が回らず開始が遅れたため。今年度、生化学実験を集中的に実施するために機器と消耗品の購入に使用する。また、短期的に研究員を雇用して研究を加速する。
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