2016 Fiscal Year Research-status Report

AR-V7陽性新規前立腺癌細胞株を用いたCRPCに対する創薬標的探索

Research Project

Project/Area Number	16K15686
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	中村英二郎京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (90293878)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	杉山愛子京都大学, 医学研究科, 特定研究員 (30642699)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2018-03-31
Keywords	CRPC
Outline of Annual Research Achievements	アンドロゲン依存性 LNCaP 細胞を長期間、同ホルモン非存在下(csFBS)での培養を行うことにより、AR-V7 の高発現を示す CRPC細胞株 (AILNCaP細胞) の樹立に成功した。同細胞株を用いて親株のLNCaP細胞とともに、shRNA library screeningを行い、in vitroにおいてCRPCに対して増殖抑制を示す治療標的分子同定を目的としてshRNA library screeningを行った。Cellecta 社の Pooled Lentiviral shRNA Libraries を使用し、方法としてはLentiviral Packaging plasmid を用いて Virus supernatant を作製しLNCaP、及び、AILNCaP細胞に、それぞれ感染を行った。これらの細胞において継代前後の DNA に対してdeep sequencing により各 shRNA fragment のリード数の解析を行った。コントロール (継代前) に比較して 8 週間の継代後にリード数が減少した shRNA が in vitro において増殖抑制作用を有していることを示す。AILNCaP細胞に対して特異的に増殖抑制作用を示す shRNA fragment の抽出を行いblast search により同 fragment の標的遺伝子の同定を試みたところ、CRPC細胞株に特異的に増殖抑制を示す複数の配列（遺伝子）の抽出に成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason CRPCに対する複数の治療標的遺伝子候補の抽出に成功していることから、平成28年度の実験に関しては順調進展していると考える。
Strategy for Future Research Activity	shRNA library screeningで絞り込まれた治療標的遺伝子に関して、臨床経過が既に明らかとなっている30例のCRPC症例標本を用いて、免疫組織染色により蛋白レベルでの発現解析を行う。治療への反応性などの臨床経過との関連性も評価した上で、CRPCに対する新規治創薬標的遺伝子となり得るか検討を行う。また、AILNCaP細胞は去勢した雄NOD-SCIDマウスでの腫瘍形成能を有していることからshGFP をコントロールとして治療標的遺伝子群のXenograft の増殖、及び、形成能に与える影響の検討を行う。
Causes of Carryover	初年度に計上してたshRNA library の購入費を軽減することが可能であったため、約１１万円の次年度使用額が発生した。
Expenditure Plan for Carryover Budget	shRNA library screeningにて複数の治療標的遺伝子がえられている。従って、同標分子群の評価に必要な抗体の購入、動物実験の費用に充てる予定である。