2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of screening method using large deletion in Marchantia polymorpha
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16K18472
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
菅野 茂夫 立命館大学, 立命館グローバル・イノベーション研究機構, 助教 (60726313)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / ゼニゴケ / 性染色体 / in silico デザイン / gRNA活性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゼニゴケの性染色体遺伝子を破壊するために，gRNAの設計ソフトの改良を行った．具体的には，オフターゲット探索を高速に処理できるようbowtieを組み込んだ．加えて，pythonを利用して，ゼニゴケゲノムDNA情報(JGI3.1)とアノテーションファイル(GFF3)から，（１）ゼニゴケの遺伝子のCDSの中心部にオフターゲットの少ないgRNAを6本設計する．（２）ゼニゴケの遺伝子のcoding領域の両端にgRNAを設計する．という機能を持ったソフトウェアを作成した．性染色体の遺伝子だけではなく，全遺伝子に対してgRNAを設計し，ゼニゴケ国際ミーティングで発表した(65th NIBB conference)．X染色体に関しては，遺伝子間領域に関してもBLAST検索を行い，JGIのアノテーションには含まれない複数の遺伝子候補を同定した．ゲノム編集ベクターにおいては複数のgRNAを同時に発現させることで，large deletionがどの程度の頻度で生じるのか確認した．形質転換株の20%ほどで4.5 kbの欠失を安定に生じさせる系を作製した．本実験と，既に証明した高効率ゲノム編集ベクターに関して，論文を執筆し，プレプリントサーバーbioRxivにて公開した(https://doi.org/10.1101/277350)．さらに，large deletionを起こすためのベクターをaddgeneにデポジットした．現在，384プレートフォーマットでオリゴを作製し，並列でコンストラクションを進めている．これらのベクターをゼニゴケに形質転換しスクリーニングを行う予定であったが，異動に伴い形質転換系がうまく動作しなくなったため，スクリーニングには至っていない．形質転換効率を上げるために新しくアガートラップ法を利用して形質転換系を立ち上げた．
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