M蛋白血症に起因する軽鎖結晶蓄積性組織球症による腎障害の病態解析と治療開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K19485
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 原 怜史 金沢大学, 附属病院, 医員 (80749820)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 軽鎖 / 発現ベクター / トランスジェニックマウス

Outline of Annual Research Achievements

１）発現ベクターの作成：当初予定していたヒト、マウスキメラ抗体ベクターに加え、より患者病態に近い可変領域・定常領域ともヒトの完全ヒト型抗体ベクターの2種類を作成する方針とした。ヒトκ定常領域のクローニングを行い、可変領域を組み込んだベクターに定常領域を組み込み、発現ベクターを作成した。
２）遺伝子導入と蛋白濃度測定：当初予定していたトランスフェクトーマの作成は、エレクトロポレーション後の細胞上清中の蛋白分泌を確認することができなかった。その原因を調べるため、RNA発現を定量的PCRにて確認すると発現を認めた。しかしながら、蛋白発現を免疫染色およびウェスタンブロット法にて確認したが、蛋白の発現は確認できなかった。そのため、ストラテジーを変更し、一過性遺伝子導入の系に実験系を変更する方針とした。lipofectamine3000を用いて、CHO細胞、HEK293細胞に遺伝子導入を行った。上清の蛋白濃度を測定すると、CHO細胞で10μg/ml、HEK293細胞で1-5μg/ml程度のκ濃度を確認し、目的の蛋白を得ることができた。
３）In vivoモデルの作成：ヒトκ定常領域を組み込んだ、トランスジェニックマウスを作成するため、コンストラクトを作成した。筑波大学へ受託依頼を行い、現在トランスジェニックマウス作成途中となっている。
４）取り込みによるIn vitroモデルの作成：マウスマクロファージであるRAW264.7をLPSにて刺激し、κを1時間インキュベートし、その後免疫染色を行ったところ、取り込まれることを確認した。
５）強制発現系によるIn vitroモデルの作成：HEK293細胞およびCHO細胞にトランスフェクションを行い、数日後に免疫染色を行った。その結果κの発現が確認された。次にHK-2という近位尿細管由来細胞を使用し、同様の検討を行ったが、こちらもκの発現が確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

発現ベクターの作製は予定通り終了したが、その後のトランスフェクトーマの作成に関して、エレクトロポレーション後の細胞上清中の蛋白分泌を確認することができなかった。このためストラテジーを変更し、一過性遺伝子導入の系に実験系を変更する方針とし、lipofectamine3000を用いて、CHO細胞、HEK293細胞に遺伝子導入を行い、目的の蛋白を得ることができた。これによる遅れが生じている。
トランスジェニックマウスの作製は現在は行っているが、2017年5月以降に実験を行うことができる見通しであり、遅れは僅かであると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

１）トランスジェニックマウスの解析：ヒトκ定常領域を組み込んだ、トランスジェニックマウスが完成予定となっている。まずは、RNA、蛋白レベルでのヒトκの発現を確認する。次に、表現型を確認するために、腎臓、肝臓の組織のHE染色、電顕を確認する。また、血清も経時的にフォローし、腎機能、血中ヒトκをフォローする。
２）取り込みによるIn vitroモデルにおける分解抵抗性の確認：2016年度に行ったマウスマクロファージにおける取り込みモデル、あるいは近位尿細管由来細胞への取り込みモデルを用いて、今回のκ蛋白が分解抵抗性であることを確認する。
３）不死化培養ポドサイトにおいても同様のκが取り込まれるか確認を行い、取り込みの機序、分解抵抗性の機序を解析する。

Causes of Carryover

消耗品を含む物品費の端数が残ったため

Expenditure Plan for Carryover Budget

今後継続して行う実験（トランスジェニックマウスおよび細胞実験）の際に必要となる物品の購入費へ充てる予定である