2017 Fiscal Year Research-status Report

TAK1抑制によるiPS細胞作成効率の改善と新規未分化維持培養系の開発

Research Project

Project/Area Number	16K21508
Research Institution	Kindai University
Principal Investigator	小野寺勇太近畿大学, 医学部附属病院, 助手 (30510911)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	間葉系幹細胞 / MSC / TAK1 / Stemness / 細胞増殖
Outline of Annual Research Achievements	間葉系幹細胞（MSC）は、自己複製能及び多分化能といった幹細胞に特徴的な能力(Stemness)を有し、生体からの収集が比較的容易であることから移植ソースとして中心的な存在となっている。しかし、発生学的な起源や制御機構については未知の点が多い。MSC制御に関わる分子の同定は、より良い移植ソースを目指す上で重要である。そこで我々は、TGFβシグナルエフェクターのTGFβ-activated kinase1 (TAK1)に着目した。幹細胞を始めとした細胞は、細胞外ストレスに対し様々な応答を行い、炎症性サイトカインや酸化ストレスが細胞を変性させる。このような細胞外ストレスは、ストレス受容分子により細胞内に伝達され、様々な分子カスケードの活性化を経て遺伝子の転写制御に関わる。TAK1はストレス受容伝達カスケードにおいて代表的な分子であり、様々な細胞内シグナル伝達経路の中でも最も上流に位置するMAP3Kの1つであることや、種を越えて幅広く保存されていることから、発生・恒常性維持において極めて重要な役割を有していると考えられる。事実、TAK1のノックアウトマウスは胎生致死となることが知られ、Stat3(Tyr705)の異所(Ser727)リン酸化を促進すること、Wnt/βカテニン経路にあるTCF/LEFの抑制すること、Smadの核移行を抑制することなど重要な知見が報告されている。さらに、核内でも機能するキナーゼとしても報告されており興味深い性質も明らかになってきている。幹細胞制御については、Nemo-like kinase（NLK）などの分子を介した幹細胞の未分化制御機構が示唆されているが、詳しいメカニズムは殆ど解明されていない。本研究では、多能性幹細胞のストレス応答におけるTAK1の役割を解明し、これを制御することで新規の多能性制御機構の解明や多能性幹細胞維持培養法の開発を目指す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ES細胞を用いたTGFβ添加実験より、中胚葉マーカーの発現が亢進していた。これより、筋・骨・軟骨・脂肪を始めとした中胚葉系の細胞へと分化可能な組織幹細胞で、継代毎に分化能・増殖能が損なわれるなどメカニズムの多くが未解明であるMSC のStemnessに対するTAK1の役割を検討した。マウス骨髄中に存在するPDGFRα(+) / Sca-1(+)　は幹細胞性に優れたMSC(PαS MSC)であることが知られている。PαS MSCのTAK1は常にリン酸化されており、細胞質及び核内の両方で発現していることがイムノブロット法によって確認された。TAK1阻害剤の添加により、核内での発現が著しく減少し、細胞増殖は抑制された。また、生細胞の細胞周期を解析出来る蛍光プローブ：Fucciが導入されたTgマウスよりMSCを樹立し、TAK1阻害によって細胞周期がどのように変化するのかFACSにより解析を行った。TAK1のリン酸化が阻害されるとG1G0期に画分が増加した。また、昨年度までにCo-IP / LC-MSMSによって抽出してきたTAK1のパートナータンパク質の発現抑制においても順次、細胞周期との関連性を検証する予定である。次に、昨年度導入したPDGFRα-Cre産生マウスとTAK1コンディショナルノックアウトマウスによる胎仔の作出はE13.5前後で致死となることが確認された。詳細な解析は今後実施して行く予定である。並行して、TAK1iの投与を2週齢のマウスに継続的に行った。有意に体重及び体躯の成長抑制が認められ、体外での結果を保管する様な結果を得ることが出来た。また、我々の別プロジェクトのアンチエイジング研究においても若齢と老齢との間にTAK1の活性化に差が認められ、幹細胞老化との関係も示唆された。次年度は、幹細胞の老化現象もヒントに論文投稿を行う予定である。
Strategy for Future Research Activity	当初の計画ではCo-IPとLC-MS(IP-MS)を駆使することでTAK1に相互作用するタンパク質の同定を行う予定であった。事前に得ていた研究成果と抽出されてきたタンパク質との間で直接機能が一致しているものも存在しており、抽出されてきたタンパク質も含めて機能解析を進めているところである。また、IP-MSに依存せず、既存のデータベースによる相互作用の予測を実施し、MSCに関して幾つかの相互作用タンパク質を検出することに成功した。いずれも報告のない新規性のあるTAK1のパートナータンパク質である。昨年度まではヒト癌細胞を用いた予備的検討による成果であったが、MSCを用いたCo-IPから同様の結果が得られたことから、来年度はデータベース解析から抽出されてきたタンパク質においてもTAK1の活性化と細胞増殖に関連した機能を中心に解析を進める予定である。さらに、並行してTAK1 flox/floxマウスを用いたコンディショナルノックアウトマウスの解析を進め、In vivoにおける発生学的な解析も予定している。 30年度はプロジェクトの最終年であることから、論文投稿に向けた総仕上げを実施する。TAK1と相互作用する興味深いタンパク質が複数見つかってきている為、より細胞増殖に対して機能性を有する、未分化能維持に有効なタンパク質に的を絞って研究成果をまとめる予定である。
Causes of Carryover	当該研究は３カ年で実施する事業であり、3年目には多くの分析を実施するためその費用として計上している.30年度実施予定の実験の中で、当初の予定通り消耗品として使用する。