2017 Fiscal Year Research-status Report
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16KT0071
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高橋 淑子 京都大学, 理学研究科, 教授 (10183857)
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| Project Period (FY) |
2016-07-19 – 2020-03-31
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| Keywords | 血管 / リモデリング / トリ胚 / 血流 / 数理モデル / 細胞挙動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血管ネットワークは、体の隅々まで張り巡らされており、生命活動の根幹的な役割を担う。血管の高次機能やその破綻機構を明らかにするためには、血管形成の仕組みの理解が欠かせない。血管形成の仕組みは、おおむね次の３つのプロセスを経る。①まず、無秩序な構造の原始血管網が作られる。②次に「血管リモデリング」と呼ばれるダイナミックな形態変化が起こり、③結果として組織立った血管パターンが作られる。これら３つの過程のうち、とくに②の血管リモデリングの機構は、ほぼ未解明のまま残されている。本研究では血管リモデリングの理解に向けて、「血流刺激→細胞による感知と応答（細胞移動など）→血管再編成→血流の更なる変化」という、ミクロからマクロまでを繋ぐ一連のメカノセンシング機構を、構成的に解析することを目的としている。
モデル動物として用いているニワトリ胚は、初期発生の過程において血管形成やリモデリングが２次元平面上で進行するため、さまざまな実験操作が可能である。そこで本年度は、血流刺激の細胞による感知・応答の分子機構の解明に向けて、血管のサブタイプ特異的な遺伝子導入効率の最適化を行った。トランスフェクション試薬（脂質）とDNAとの混合体を心臓に注入すると、血流にのって注入DNAが拡散することで、トリ胚のさまざまな血管内皮細胞に遺伝子導入が可能であることがわかった。なかでも卵黄動脈をターゲットとした遺伝子操作法の開発を集中的に進めたところ、DNA/脂質混合体の注入時期や注入場所（たとえば背側大動脈）を調節することで、遺伝子導入効率が大きく変化することがわかった。生体内における心臓・血管発生のしくみを利用した、新たな血管操作法の基盤を整備することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
市販のトランスフェクション試薬を用いた血管内皮サブタイプ特異的な遺伝子操作法に関しては、これまで例がない。そこでこれらの研究成果を、研究コミュニティに広くかつ迅速に発信するために原著論文としてまとめるべく、入手可能な試薬を多種類購入して、それらを比較する必要があった。そのうちいくつかは、製造上の事情から納品時期が遅れるなど、計画が若干遅れた。加えて、血管内皮サブタイプ特異的な遺伝子操作にあたり、siRNA法の導入も試みたが、デザインしたsiRNAが期待通りの発現抑制効果を示さなかったことから、新たな配列を再設計する必要があるなど、予定よりも手間取る作業があった。
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| Strategy for Future Research Activity |
予定していたトランスフェクション試薬はすべて入手できたので、これらを比較して、遺伝子導入効率最適化の仕上げに向かう。またsiRNA配列の設計も軌道にのりつつある。GOFとLOFを組みあわせることで、血管内皮サブタイプ特異的な遺伝子操作法開発を完成させたい。本研究で以前進めてきた胚内血流操作法と組み合わせることで、血流変化による血管内皮細胞の挙動変化を高解像度で解析できる基盤が整備され、血流刺激を感知する分子機構について、血管内皮細胞で働く遺伝子群の絞り込みをより高効率に進める。
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| Causes of Carryover |
理由：siRNA配列をさらに多種類準備する必要が生じた。本年度開発した血管内皮サブタイプ特異的な遺伝子操作法を用いた胚操作用の費用が次年度に必要となった。これらの胚操作および胚内の血管内皮細胞の高解像度挙動観察のために、コンフォーカル顕微鏡の整備が次年度に必要となった。
使用計画：血流刺激を感知する分子機構に関与することが想定される遺伝子について、それぞれsiRNA解析を行う。またこれらsiRNAを血管内皮サブタイプ特異的に発現させたときの、GFP標識した血管内皮細胞を、コンフォーカル顕微鏡を用いて高解像度で観察する。これらの解析をとおして、血流と血管リモデリングをつなぐ細胞動態とその分子機構の実体に迫る。
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