2016 Fiscal Year Research-status Report
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16KT0166
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
中村 卓 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 准教授 (80344050)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤本 和宏 北陸大学, 薬学部, 講師 (00511255) [Withdrawn]
田中 成典 神戸大学, システム情報学研究科, 教授 (10379480)
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| Project Period (FY) |
2016-07-19 – 2019-03-31
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| Keywords | 遷移状態構造 / 活性化エネルギー / 計算精度 / 計算結果と実験結果の対応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、研究代表者と研究分担者で開発した遷移状態（TS）エネルギー分割解析法の簡便性、精度の向上を目指す研究や、巨大分子を核酸やアミノ酸などの断片（フラグメント）ごとに計算することで巨大分子の高精度計算を行なうことのできるフラグメント分子軌道（FMO）法によるTS構造の基質－酵素間相互作用の解析法の開発を行ない、実験研究者がこれらの手法を機能改良酵素創製の有効な手段として利用できるようにすることを最終目的としている。そのためにまず、以下の内容に取り組んだ。
1.TSエネルギー分割解析法の改良について
TSエネルギー分割解析法を改良するためには、妥当な活性化エネルギー値を与えるTS構造の決定方法をまず確立する必要がある。実験では室温で酵素反応が進行するような反応系でも、これまでの計算（計算精度よりも計算時間を重視している半経験的手法）では、室温で反応が起こり得ないような高い活性化エネルギーの値が得られた。そこで、計算時間はかかるものの分散力のような弱い相互作用を考慮した非経験的手法で計算したところ、数日程度の計算時間で活性化エネルギーの値が実験結果と対応した。
2.機能改良酵素作製実験と酵素活性の確認
研究代表者が現在取り組んでいる、ハロ酸脱ハロゲン化酵素のフルオロ酢酸（MFA）分解活性の向上のための機能改良酵素作製実験で、本研究手法の有用性を検証した。半経験的手法で得られた計算結果より野生型よりも活性向上が期待される変異体酵素2種類を実際に発現、精製した後、MFA分解活性を測定した。その結果、デザインされた酵素の活性は野生型より大幅に低下した。円偏光二色性スペクトル法で2次構造の温度依存性を調べたところ、これらの変異体酵素は野生型酵素よりも低温で変性する可能性が示唆されたため、計算を行なう際に、変異導入による酵素の立体構造への影響も考慮する必要があることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ハロ酸脱ハロゲン化酵素のMFA分解活性向上のための機能改良酵素作製実験では、MFA分解活性の向上が期待される変異体酵素の計算結果と実験結果の対応は見られなかった。しかし、活性化エネルギーが下がるTS構造の目安や、活性向上の期待される変異体酵素を正しく推測するための計算手法が明らかになりつつあることなどから、研究開始時よりも研究の進展はみられていると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずはハロ酸脱ハロゲン化酵素のMFA分解活性向上のための機能改良酵素作製実験で、MFA分解活性の向上した変異体酵素を計算で正しく予測できる手法を開発する。現時点では、妥当な変異を導入するためのノウハウがまだできておらず、立体構造を確認しながら手当たり次第に変異を導入して計算しているが、活性化エネルギーを低下させるTS構造の特徴を簡便に見出すことができれば、それを参考に効率よく変異導入箇所を推定できると思われる。そこで、TSエネルギー分割解析法やFMO法による相互作用解析法を上記のTS構造推定に結び付けられるように、これまでの計算結果やこれから行う計算結果から両者の関連性を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
購入予定の試薬や器具類が予想よりも少ない量で実験を進めることができたため、差額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
差額の分は次年度の物品費に組み込んで利用する。
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