2018 Fiscal Year Annual Research Report

Development of analysis method of transition state for improvement of enzymatic function

Research Project

Project/Area Number	16KT0166
Research Institution	Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
Principal Investigator	中村卓長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 准教授 (80344050)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	藤本和宏北陸大学, 薬学部, 講師 (00511255) [Withdrawn] 田中成典神戸大学, システム情報学研究科, 教授 (10379480)
Project Period (FY)	2016-07-19 – 2019-03-31
Keywords	計算精度 / 遷移状態構造 / 活性化エネルギー / 実験結果と計算結果の対応 / 反応経路自動探索 / 加水分解反応 / ハロ酸脱ハロゲン化酵素
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、研究代表者と研究分担者で開発した遷移状態（TS）エネルギー分割解析法の簡便性、精度の向上を目指す研究や、タンパク質や核酸といった巨大生体分子の高精度計算を行なうことのできるフラグメント分子軌道（FMO）法によるTS構造の基質－酵素間相互作用の解析法の開発を行ない、実験研究者がこれらの手法を機能改良酵素創製の有効な手段として利用できるようにすることを最終目的としている。 TSエネルギー分割解析法を改良するためには、妥当な活性化エネルギー値を与えるTS構造の決定方法をまず確立する必要がある。モデル酵素の反応（ハロ酸脱ハロゲン化酵素のハロ酸分解反応）の量子力学/分子力学（QM/MM）計算において、計算精度よりも計算時間を重視している半経験的手法では、実験結果と対応しない高い活性化エネルギーの値が得られた。また、これまでは活性の低い基質との反応におけるTS構造探索を行い、その活性化エネルギーを下げることを目指す計算を行っていたが、本来の基質であるL-2-クロロプロピオン酸を用いて実験結果と対応する反応経路を探索することが先決だと考えた。そこで、2018年度は、自動反応経路探索プログラムを使用して分散力のような弱い相互作用も考慮した非経験的手法でQM領域を最低限にして実験結果と対応する反応経路探索を行った。その結果、2段階の脱ハロゲン化反応のうち、反応座標が1つで単純な第1段階の脱塩素化反応は、これまでと同様、活性化エネルギーの値が実験結果と対応する大きさであった。反応座標が複数あり複雑な第2段階の加水分解反応では、反経験的手法と非経験的手法で得られるTS構造の数が異なり、反経験的手法では2つあるTSが、非経験的手法では１つであった。また、律速となる反応段階の活性化エネルギーの値はどちらの手法でも大差ない結果となり、実験結果と対応する反応経路を決定できなかった。