ラフトのコレステロールに結合するPFOタンパク質の構造遷移と相互作用様式の解明

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17048009
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 片平 正人 横浜市立大学, 国際総合科学研究科, 教授 (70211844)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩下 淑子 財団法人東京都高齢者研究, 福祉振興財団・東京都老人総合研究所, 副参事研究員 (50111498)
• Keywords: 生体分子 / 生物物理 / 蛋白質 / ラフト / NMR / 立体構造 / コレステロール / 膜

Research Abstract

細胞膜にはスフィンゴ脂質とコレステロールに富んだ機能的脂質ドメイン(ラフト)が存在している。Perfringolysin O(PFO)タンパク質は、ラフト中のコレステロールを選択的に認識して結合し、最終的には細胞に穴を開け破壊する毒素である。我々はこれまでに、PFOタンパク質を改変、無毒化することによってコレステロールに特異的なプローブ(BCθ)を作製し、BCθが脂質ミクロドメイン(ラフト)中のコレステロール密度の高い領域に選択的に結合することを見いだしている。
今回BCθを用いた解析により、従来「ラフト画分」として用いられてきた画分が、コレステロール含有率の高い(BCθ結合性の)膜と低い(BCθ非結合性の)膜の混合物であることが明らかになった。そしてJurkat細胞から分離したBCθ結合性のラフト膜サブセットには、ラフトマーカー分子の他に、T細胞情報伝達を正・負に制御する分子群が検出された。一方、受容体刺激による活性化に伴って、BCθ結合性の膜領域に移行してくる分子の存在も明らかになった。
我々はPFOタンパク質中の約110アミノ酸からなる部位(D4)が、ラフト中のコレステロールへの選択的な結合能を有する事を見出した。大腸菌の菌体破砕液の不溶性画分に存在するD4を、アルギニン法によってリフォールディングする事で、安定して調製できるようになった。この試料に3重共鳴法を適用する事により、主鎖の帰属をある程度行うことができた。
また膜環境を模した状態における構造解析を行う為に、D4をミセルに取り込ませる事を試みた。この状態におけるCDスペクトルは、水中におけるものとは少し異なっていた。さらにより膜の環境に近づける為に、コレステロール含有のリポソームを調製し、そこにD4を取り込ませた。この状態のCDスペクトルも、水中におけるものとは少し異なっていた。

Research Products

• [Journal Article] a novel nuclear matrix protein, binds to the Ars insulator and canonical MARs (2006)
  • Author(s): Tagashira, H., Shimotori, T., Sakamoto, N., Katahira, M., Miyanoiri, Y., Yamamoto, T., Mitsunaga-Nakatsubo, K., Kusunoki, S., Akasaka, K., Unichrom
  • Journal Title: Zoological science 23 Pages: 9-21
• [Journal Article] Structural property of DNA that migrates faster in gel electrophoresis, as deduced by CD spectroscopy, Nucleosides (2006)
  • Author(s): Matsugami, A., Tani, K., Ouhashi, K., Uesugi, S., Morita, M., Ohyama, T., katahira M.
  • Journal Title: Nucleotides and Nucleic Acids (in press)
• [Journal Article] Identification of 2-(cysteinyl)amido-2-deoxy-D-galacturonic acid residue from the sheath of Leptothrix cholodnii (2006)
  • Author(s): Makita, H., Nakahara, Y., Fukui, H., Miyanoiri, Y., Katahira, M., Seki, H., Takeda, M., Koizumi, J.
  • Journal Title: Biosci.Biotech.& Biochem (in press)
• [Journal Article] Molecular mechanism for maintenance of G-rich short tandem repeats capable of adopting G4 DNA structures (2006)
  • Author(s): Nakagama, H., Higuchi, K., Tanaka, E., Tsuchiya, N., Nakashima, K., Katahira, M., Fukuda, H.
  • Journal Title: Mutat.Res. (in press)
• [Journal Article] Structure of hnRNP D : single-stranded telomere DNA complex and unfolding of quadruplex by hnRNP D (2005)
  • Author(s): Enokizono, Y., Konishi, Y., Uesugi, S., Ishikawa, F., Katahira, M.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280 Pages: 18862-18870
• [Journal Article] H., Unfolding T higher DNA structures formed by the d(CGG) triplet repeat by UP1 protein (2005)
  • Author(s): Fukuda, H., Katahira, M., Tanaka, E., Enokizono, Y., Tsuchiya, N., Higuchi, K., Nagao, M., Nakagama
  • Journal Title: Genes Cells 10 Pages: 953-962
• [Journal Article] P.K.R., Human vault-associated non-coding RNAs bind to mitoxantrone, a chemotheraneutic compound (2005)
  • Author(s): Gopinath, S.C.B., Matsugami, A., Katahira.M., Kumar
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. 33 Pages: 4874-4881
• [Journal Article] Structure of RNA aptamer complexed with an RNA-binding peptide of Tat with aid of residue-epecific ^<13>C, ^<15>N labeling (2005)
  • Author(s): Matsugami, A., Tochio, H., Niyada, E., Tamura, Y., Kudo, M., Misono, T., Kumar, P., Katahira, M.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res.Suppl. 5 Pages: 69-70
• [Journal Article] Separation of a cholesterol-enriched microdomain involved in T-cell signal transduction (2005)
  • Author(s): Shimada, Y., Inomata, M., Suzuki, H., Hayashi, M., Waheed, A.A., Ohno-Iwashita, Y.
  • Journal Title: FEBS J. 272 Pages: 5454-5463
• [Journal Article] Role for upregulated ganglioside biosynthesis and association of Src family kinases with microdomains in retinoic acid-induced differentiation of F9 embryonal carcinoma cells (2005)
  • Author(s): Sato, T., Zakaria, A.M., Uemura, S., Ishii, A., Ohno-Iwashita, Y., Igarashi, Y., Inokuchi.JI.
  • Journal Title: Glycobiology 15 Pages: 687-699
• [Journal Article] Structure an function of lipid rafts in human activated T cells' (2005)
  • Author(s): Tani-ichi, S., Maruyama, K., Kondo, N., Nagafuku, M., Kabayama, K., Inokuchi, J., Shimada, Y., Ohno-Iwashiita, Y., Yagita, H., Kawano, S., Kosugi, A.
  • Journal Title: International Immunology 17 Pages: 749-758
• [Journal Article] Adhesive surface determines raft composition in platelets adhered under flow (2005)
  • Author(s): van Lier, M., Lee, F., Farndale, R.W., Gorter, G., Verhoef, S., Ohno-Iwashita, Y., Akkerman, J.W.N., Heijnen, H.F.G
  • Journal Title: J.Thromb.Haemost 3 Pages: 2514-2525