アスパルテーム合成の高効率化を目的とするサーモライシンの蛋白質工学と反応制御工学

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17380065
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 保川 清 京都大学, 農学研究科, 助教授 (30397559) ; 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助手 (70263126)
• Keywords: 酵素 / 蛋白質工学 / 反応制御 / ペプチド / 食品

Research Abstract

サーモライシン(以下TLNと略す)は高濃度の塩の添加により十数倍も活性が上昇する。低塩濃度下での低活性型から高塩濃度下での高活性型に移行する分子機構を検討するため、4M NaCl存在下でのX線結晶解析を行なった。大きい構造変化は認められなかったが、NドメインとCドメインの間がやや開くことが認められ、これが活性化に関与する可能性が示された。われわれはTLNの天然型変異体としてTa(Val140Ala)とTb(Ala73Val)を見出している。変異型Taで140位のバリンがアラニンに変換されている。これは、野生型TLNに比べ、好塩性とZAPM合成能が上昇した。Tbでは73位のアラニンがバリンに変換されており、これは野生型酵素に比べZAPM合成能が低下した。蛋白質分解活性はTaで低下、Tbで上昇した。このような基質特異性の変化をもたらす構造因子を解明し、TaとTbの構造を野生型TLNの構造と比較するためにX線結晶解析を行なった。三者の間に明確な構造上の差異を見出せず、酵素機能の発現が極めて微小の構造変化に支えられていることを確認した。われわれは、活性部位にあるZnから20Å以内で水との接触率が20%以上のセリン残基8個をアスパラギン酸またはリジンに変換し、電荷を導入し、好塩性に対する分子表面静電場の効果を検討した。Ser53AspおよびSer65Asp変異体は高い熱安定性を示した。分光学(吸光度、蛍光、円二色性スペクトル)を用いて、この安定化の原因を検討した。さらにTLN分子表面と活性部位残基の改変による活性の増強、アスパルテーム合成反応中における原料と生成物の安定化を目的にTLNの至適pHの酸性域への拡大、TLNの長時間の活性保持を目的に自己消化の抑制と安定化を達成した。

Research Products

• [Journal Article] Characterization of Glt-D-Phe, Gly-L-Leu, and D-Phe as affinity ligands to thermolysin. (2006)
  • Author(s): Yasukawa, K., Kusano, M., Nakamura, K., Inouye, K.
  • Journal Title: Protein Expression and Purification 46 Pages: 332-336
• [Journal Article] Dissociation/association properties of a dodecameric cyclomaltodextrinase. Effects of pH and salt concentration on the oligomeric state. (2006)
  • Author(s): Lee, H.-S., Kim, J.-S., Shim, K., Kim, J.-W., Inouye, K.etc.
  • Journal Title: FEBS J 273 Pages: 109-121
• [Journal Article] Extracellular production of recombinant thermolysin expressed in Escherichia coli, and its purification and enzymatic characterization. (2006)
  • Author(s): Inouye, K, Minoda, M, Takita, T, Yasukawa, K, etc.
  • Journal Title: Protein Expression and Purification 46 Pages: 248-255
• [Journal Article] Anomalous pH-dependence of the activity of human matrilysin (matrix metalloproteinase-7) as revealed by nitration and amination of its tyrosine residues. (2005)
  • Author(s): Muta, Y., Oneda, H., Inouye, K.
  • Journal Title: Biochem.J. 386(2) Pages: 263-270
• [Journal Article] Metabolism of 26,26,26,27,27,27-F6-1a,23S,25-trihydroxyvitamin D3 by human UDP-glucuronosyltransferase 1A3. (2005)
  • Author(s): Kasai, N., Sakaki, T., Shinkyo, R., Kamao, M., Ohta, M., Inouye, K.etc.
  • Journal Title: Drug Metabol.Dispos. 33(1) Pages: 102-107
• [Journal Article] Functional properties of soy protein hydrolysates obtained by selective proteolysis. (2005)
  • Author(s): Tsumura, K, Saito, T., Kugimiya, W., Inouye, K etc.
  • Journal Title: Food Sci.Technol./LWT 38(3) Pages: 255-261
• [Journal Article] Metabolism of vitamin D3 by cytochromes P450. (2005)
  • Author(s): Sakaki, T., Kagawa, N., Yamamoto, K., Inouye, K.
  • Journal Title: Frontiers in Bioscience. 10(1) Pages: 119-134
• [Journal Article] Evidence of the occurrence of membrane-type serine protease 1/matriptase on the basolateral sides of enterocytes. (2005)
  • Author(s): Tsuzuki, S., Murai, N., Inouye, K., Iwanaga, T., Fushiki, T etc.
  • Journal Title: Biochem.J. 388(2) Pages: 679-687
• [Journal Article] Emulsifying properties of a peptide from peptic hydrolysates of soy glycinin. (2005)
  • Author(s): Tsumura, K., Kugimiya, W., Inouye, K.
  • Journal Title: Food Sci.Technol.Res. 11(1) Pages: 46-51
• [Journal Article] Preliminary X-ray crystallographic analysis of thermolysin in the presence of 4 M NaCl. (2005)
  • Author(s): Kamo, M., Inouye, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Acta Crystallographica D 61(6) Pages: 710-712
• [Journal Article] Measurement and characterization of C-3 epimerization activity toward vitamin D3. (2005)
  • Author(s): Kamao M., Hatakeyama, S., Inouye, K., Kubodera, N., Reddy, G.S etc.
  • Journal Title: Arch.Biochem.Biophys. 436(1) Pages: 196-205
• [Journal Article] Identification of amino acid residues of CYP27B1 responsible for binding of 25-hydroxyvitamin D3 whose mutation causes vitamin D3-dependent rickets type I. (2005)
  • Author(s): Yamamoto, K., Uchida, E., Kato, S., Inouye, K., Yamada, S etc.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280(34) Pages: 30511-30516
• [Journal Article] Catalytic properties of an organic solvent resistant tyrosinase from Streptomyces sp. REN-21 and its high-level production in Escherichia coli. (2005)
  • Author(s): Ito, M., Inouye, K.
  • Journal Title: J.Biochem. 138(4) Pages: 355-362
• [Journal Article] Identification of a novel cytotoxic proteins, Cry45Aa, from Bacillus thuringiensis A1470 strain and its selective cytotoxic activity against various mammalian cell lines. (2005)
  • Author(s): Okumura, S., Saitoh, H., Ishikawa, T., Mizuki, E., Inouye, K etc.
  • Journal Title: J.Agric.Food Chem. 53(16) Pages: 6313-6318
• [Journal Article] Metabolism of 2a-propexy-1a, 25-dihydroxyvitamin D3 by human CYP27A1 and CYP24A1. (2005)
  • Author(s): Abe, D., Sakaki, T., Kusudo, T., Kittaka, A., Ohta, M., Inouye, K etc.
  • Journal Title: Drug Metabolism and Disposition 33(6) Pages: 778-784
• [Journal Article] Mutational effect for stability in a conserved region of thermolysin. (2005)
  • Author(s): Matsumiya, Y., Nishikawa, K., Inouye, K., Kubo, M.
  • Journal Title: Lett.Appl.Microbiol. 40 Pages: 329-334
• [Journal Article] Rat cytoichrome P450-mediated transformation of dichlorodibenzo-p-dioxins by recombinant White-rot basidiomycete Coriolus hirsutus. (2005)
  • Author(s): Orihara, K., Yamazaki, T., Inouye, K., Tsukamoto, A., Shishido, K etc.
  • Journal Title: Appl.Microbiol.Biotechnol. 69 Pages: 22-28
• [Journal Article] Determination of biotinylated proteins as an index for purification of plasma membrane using surface plasmon resonance-based optical biosensor. (2005)
  • Author(s): Okumura, S., Akao, T., Yamashita, S., Ichimatsu, T., Inouye, K.
  • Journal Title: Cytotechnology, 47 Pages: 59-67
• [Journal Article] Distribution, structure, organ-specific expression and phylogenic analysis of the PR-3 chitinase gene family in rice (Oryza sativa L.).
  • Author(s): Nakazaki, T., Tsukiyama, T., Okumoto, D., Inouye, K.etc.
  • Journal Title: Genome (印刷中)
• [Journal Article] Purification and characterization of a D-fructose-1,6-bisphosphate aldolase from red alga, Gracilaria chorde Holmes.
  • Author(s): Kakita, H., Kamishima, H., Inouye, K.
  • Journal Title: Marina Botanica (印刷中)
• [Journal Article] Efficient solubilization, activation, and purification of recombinant Cry45Aa of Bacillus thuringiensis expressed as an Escherichia coli inclusion body.
  • Author(s): Okumura, S., Saitoh, H., Higuchi, K., Mizuki, E., Inouye, K etc.
  • Journal Title: Protein Expression and Purification (印刷中)
• [Book] 入門 酵素と補酵素の化学(原著:T.D.H.Bugg : Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry, 2nd Edition, Blackwell, Oxford, UK, 2004, ISBN 1-4052-5 ; pp.292) (2006)
  • Author(s): 井上國世(翻訳)
  • Total Pages: 320
  • Publisher: シュプリンガー・フェアラーク東京
• [Book] 酵素ハンドブック(第3版) (2006)
  • Author(s): 井上國世(共著)
  • Publisher: 朝倉書店(印刷中)
• [Book] 機能性糖質素材の開発と食品への応用 (2005)
  • Author(s): 井上國世(監修)
  • Total Pages: 447
  • Publisher: シーエムシー出版
• [Book] 総論-糖質の機能-、「機能性糖質素材の開発と食品への応用」(井上國世監修) (2005)
  • Author(s): 井上國世(共著)
  • Total Pages: 3-23
  • Publisher: シーエムシー出版
• [Book] グルコシル化アスコルビン酸の製造と食品の抗酸化作用、「機能性糖質素材の開発と食品への応用」(井上國世 監修) (2005)
  • Author(s): 井上國世(共著)
  • Total Pages: 284-294
  • Publisher: シーエムシー出版