アスパルテーム合成の高効率化を目的とするサーモライシンの蛋白質工学と反応制御工学

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17380065
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 保川 清 京都大学, 農学研究科, 助教授 (30397559) ; 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助手 (70263126)
• Keywords: 酵素 / 蛋白質工学 / 反応制御 / ペプチド / 食品

Research Abstract

サーモライシン(以下TLNと略す)は高濃度の塩の添加により十数倍も活性が上昇する。低塩濃度下での低活性型から高塩濃度下での高活性型への移行に関する分子機構を検討するため、4M NaCl存在下でTLNのX線結晶解析を行なった。大きい構造変化は見られないが、NドメインとCドメインの間隙がやや開き、これが活性化に関与する可能性がある。このことは、4MNaCl存在下において観測されたTrp残基の溶媒露出度とANS結合度の増大によく対応した。TLNの大量かつ効率的な精製法の確立を目的として、アフィニテイークロマトグラフィー用ゲルを開発した。基材としてToyopearl HW-65を用い、これに炭素(あるいは酸素)原子数2、11、13個のスペーサーを介し、各種リガンドを導入した。樹脂に対するTLNの結合定数と最大吸着量を比較したところ、スペーサー長は13原子分で、リガンドGly-D-Pheを持つ場合が最も効果的であることが示された。従来TLNの大腸菌内で発現では、発現させたプレプロ体を自己触媒的に活性化し成熟体を得るが、変異酵素では特異性の変化や活性低下によりプレプロ断片がうまく除去できず、変異酵素を調製できないことがある。今回、プレプロ配列と成熟配列を別々かつ同時に大腸菌発現させ、従来法では得られなかった変異酵素を得る方法を開発した。TLNに[G8C/N60C/S65P/L144S]の4重変異を導入し、活性と安定性が顕著に増大した変異型酵素を作出した。TLNに各種二糖類を添加したところ安定性が増大し、とくにトレハロースにより熱変性温度は17℃も上昇し、T50は85℃であった。TLNの初発自己消化点L155-I156に変異を導入した[L155S/I156N]あるいは[L155S/I156V]では自己消化が完全に抑制されており、使用安定性の高い酵素が得られた。

Research Products

• [Journal Article] Kinetic analysis of the activation-and-inhibition dual effects of cobalt ion on thermolysin activity. (2007)
  • Author(s): Hashida, Y., Inouye, K.
  • Journal Title: J. Biochem (印刷中)
• [Journal Article] Molecular mechanism of the inhibitory effect of cobalt ion on thermolysin activity and the suppressive effect of calcium ion on the cobalt ion-dependent inactivation of thermolysin. (2007)
  • Author(s): Hashida, Y., Inouye, K.
  • Journal Title: J. Biochem (印刷中)
• [Journal Article] Effects of site-directed mutagenesis of the surface esidues Gln128 and Gln225 of thermolysin in its catalytic activity. (2007)
  • Author(s): C.Tatsumi, Y.Hashida, K.Yasukawa, K.Inouye
  • Journal Title: J. Biochem (印刷中)
• [Journal Article] Purification to homogeneity of a neutral metalloproteinase from Streptomyces caespitousus. (2007)
  • Author(s): Inouye, K., Shimada, T., Yasukawa, K.
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology and Biochemistry (印刷中)
• [Journal Article] Role of Gln 85 of human CYP27Al in 25-hydroxyvitamin D3-binding and protein folding. (2007)
  • Author(s): Sawada, N., Yamamoto, K., Yamada, S., Ikushiro, S., Kamakura, M., Ohta, M., Inouye, K., Sakaki, T.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. 355(1) Pages: 211-216
• [Journal Article] Extracellular production of recombinant thermolysin expressed in Escherichia coli, and its purification and enzymatic characterization. (2006)
  • Author(s): Inouye, K., Minoda, M., Takita, T., Sakurama, H., Hashida, Y., Kusano, M., Yasukawa, K.
  • Journal Title: Protein Expression and Purification 46 Pages: 248-255
• [Journal Article] Characterization of Glt-D-Phe, Gly-L-Leu, and D-Phe as affinity ligands to thermolysin. (2006)
  • Author(s): Yasukawa, K., Kusano, M., Nakamura, K., Inouye, K.
  • Journal Title: Protein Expression and Purification 46 Pages: 332-336
• [Journal Article] Distribution, structure, organ-specific expression, and phylogenic analysis of the pathogenesis-related protein-3 chitinase gene family in rice (Oryza sativa L.) (2006)
  • Author(s): Nakazaki, T., Tsukiyama, T., Okumoto, Y., Kageyama, D., Naito, K., Inouye, K., Tanisaka, T.
  • Journal Title: Genome 49(6) Pages: 619-630
• [Journal Article] Purification and some properties of a D-fructose-1, 6-bisphosphate aldolase from red alga. Gracilaria chorde Holmes. (2006)
  • Author(s): Kakita, H., Kamishima, H., Inouye, K.
  • Journal Title: Potanica Marina 49(2) Pages: 174-181
• [Journal Article] Structure-function analysis of vitamin D 24-hydroxylase (CYP24A1) by site-directed mutagenesis : amino acid residues responsible for species-based difference of CYP24A1 between humans and rats. (2006)
  • Author(s): Hamamoto, H., Kusudo, T., Urushino.N., Masuno, H., Yamamoto, K., Yamada, S., Kamakura, M., Ohta, M., Inouye, K., Sakaki, T.
  • Journal Title: Molecular Pharmacology 70(1) Pages: 120-128
• [Journal Article] Interaction between mitochondrial CYP27B1 and adrenodoxin : Role of arginine 458 of mouse CYP27B1. (2006)
  • Author(s): Urushino, N., Yamamoto, K., Kagawa, N., Ikushiro, S., Kamakura, M., Yamada, S., Kato, S., Inouye, K., Sakaki, T.
  • Journal Title: Biochemistry 45(14) Pages: 4405-4412
• [Journal Article] Engineering of the pH-dependence of thermolysin activity as examined by site-directed mutagenesis of Asn112 located at the active site of thermolysin. (2006)
  • Author(s): Kusano, M., Yasukawa, K., Hashida, Y., Inouye, K.
  • Journal Title: J. Biochem 139(6) Pages: 1017-1023
• [Journal Article] Comparison of starch hydrolysis activity and thermal stability of two Bacillus licheniformis ・-amylases and insights into engineering ・-amylase variants active at acidic conditions. (2006)
  • Author(s): Lee, S., Oneda, H., Minoda, M., Tanaka, A., Inouye, K.
  • Journal Title: J. Biochem 139(6) Pages: 997-1005
• [Journal Article] Comparison of the wild-type・-amylase and its variant enzymes of Bacillus amyloliquefaciens in their activity and thermal stability, and inshights into engineering the thermal stability of Bacillus・-amylase. (2006)
  • Author(s): Lee, S., Mouri, Y., Minoda, M., Oneda, H., Inouye, K.
  • Journal Title: J. Biochem 139(6) Pages: 1007-1015
• [Journal Article] Efficient solubilization activation, and purification of recombinant Cry45Aa of Bacillus thuringiensis expressed as inclusion bodies in Escherichia coli. (2006)
  • Author(s): Okumura, S., Saitoh, H., Wasano, N., Katayama, H., Higuchi, K., Mizuki, E., Inouye, K.
  • Journal Title: Protein Expression and Purification 47(1) Pages: 144-151
• [Journal Article] Effect of high concentration of sdalts on the esterase activity and structure of kiwifruit peptidase. (2006)
  • Author(s): Morimoto, K., Furuta, E., Hashimoto.H., Inouye, K.
  • Journal Title: J. Biochem 139(6) Pages: 1065-1071
• [Journal Article] Enzymatic properties of human CYP2W1 expressed in Escherichia coli. (2006)
  • Author(s): Yoshioka, H., Kasai, N., Ikushiro, S., Shinkyo, R., Kamakura, M., Ohta, M, Inouye, K., Sakaki, T.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. 345(1) Pages: 169-174
• [Journal Article] Biodegradation of dioxins by recombinant Escherichia coli expressing rat CYP1Al or its mutant. (2006)
  • Author(s): Shinkyo, R., Kamakura, M., Ikushiro, S.-I., Inouye, K.
  • Journal Title: Applied Microbiology and Biotechnology 73(3) Pages: 584-590
• [Journal Article] Uronic acid determination by high performance liquid chromatography with postcolumn fluorescent (2006)
  • Author(s): Kakita, H., Kamishima, H., Inouye, K.
  • Journal Title: Journal of Chromatography A 1129(2) Pages: 296-299
• [Journal Article] Dissociation/association properties of a dodecameric cyclomaltodextrinase. Effects of pH and salt concentration on the oligomeric state. (2006)
  • Author(s): Lee, H.-S., Kim J.-S., Shim, K., Kim, J.-W., Inouye, K., Oneda, H., Kim, Y.-W., Cheong, K.-A., Cha, H., Woo, E.-J., Auh, J.H., Lee, S.-J.Kim J.-W., Park, K.-H.
  • Journal Title: FEBS J. 273 Pages: 109-121
• [Journal Article] 微生物アミラーゼを用いるデンプン加工工業の問題点と今後の課題. (2006)
  • Author(s): 長谷川信弘, 井上國世
  • Journal Title: Bio Industry 2006(10) Pages: 23-31
• [Journal Article] プロテアーゼによるダイズタンパク質の消化分解と特性の改変 (2006)
  • Author(s): 井上國世
  • Journal Title: Bio Industry 2006(10) Pages: 40-48
• [Book] シュプリンガー・フェアラーク東京 (2006)
  • Author(s): 井上國世(翻訳)
  • Total Pages: 320
  • Publisher: 入門 酵素と補酵素の化学
• [Patent(Industrial Property Rights)] 微生物由来の菌体外プロテアーゼを生産するためのベクターおよびその利用 (2006)
  • Inventor(s): 井上國世, 保川清, 草野正雪
  • Industrial Property Rights Holder: 京都大学
  • Industrial Property Number: 日本国特許出願.出願番 号:特願2006-268935
  • Filing Date: 2006-09-29