2005 Fiscal Year Annual Research Report
アンジオテンシン受容体シグナルクロストークのプロテオームの解析
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17390068
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
岩尾 洋 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (00137192)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
泉 康雄 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (10347495)
塩田 正之 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (30381990)
中尾 隆文 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (50326261)
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| Keywords | アンジオテンシン / プロテオーム解析 / TAPタグ / Akt |
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| Research Abstract |
近年、肥満・糖尿病・高血圧・脂質代謝異常の病態が密接に関連すると考えられるメタボリック症候群においてもレニン・アンジオテンシン系の関与が指摘されている。治療薬を開発するには、互いに影響しあい複雑に絡み合う細胞内情報伝達のクロストークを網羅的に解析することが非常に重要である。本研究では、TAPタグ付き蛋白を発現させアンジオテンシン受容体刺激を介する細胞内情報伝達系のクロストークを、プロテオーム解析することにより蛋白質相互反応を捕らえることにより各病態に特有な蛋白質相互作用ならびに遺伝子相互作用を明らかにする。
(1)遺伝子導入用TAPタグ付きベクターの作成(Erk1,ASK1,Akt)と組み換えアデノウイルス作成:マウスゲノミックDNAをBACライブラリーから遺伝子を得る。pBluescripts (BSK)に遺伝子の翻訳開始部位前後を含む約10kbをプローブとして導入する。遺伝子の翻訳終止点の直前にタグ構造を挿入する。同様にC末端にTAPタグを結合させた後、発現ベクターに挿入する。293細胞にトランスフェクションし組み換えアデノウイルスを作製し増殖させ、組み換えウイルスを精製する。(2)培養血管平滑筋ならびに内皮細胞への遺伝子導入:TAPタグ付き遺伝子組換えアデノウイルを血管平滑筋ならびに内皮細胞に遺伝子導入する。導入後に各種刺激を行い経時的にプロテオーム解析を行う。(3)プロテオーム解析:病態モデルより、経時的に標的臓器からタンパク粗分画液を調製し2段階のアフィニティー精製を行う。アフィニティー精製を行ったタンパク群をMALDI-MS/MSにより網羅的に会合タンパクのアミノ酸配列を決定する。
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