| Research Abstract |
本年度は以下の実験を実施した
1)Nrf2に相互作用する因子の同定
昨年度,Nrf2に特異的に相互作用する因子としてBAF53を同定したが,今回そのBAF53を含むクロマチン構造変換複合体の中心サブユニットであるBRG1がNrf2と相互作用することを免疫沈降により見いだした.BRG1のノックダウンおよび一過性過剰発現の実験から,BRG1はHO-1遺伝子の発現を選択的に増強させることがわかった.さらに.HO-1遺伝子の発現増強には,BRG1によるHO-1遺伝子プロモーター付近のZ-DNA形成が重要であることを明らかにした.現在,Nrf2転写制御メカニズムを解析するため,FLAG標識を連結したNrf2,N末端の転写活性化ドメインNeh4およびNeh5の欠損変異体,および各種アミノ酸変異体を,テトラサイクリン誘導性に発現する細胞株を構築したので,これらの細胞株を用いて,Nrf2と相互作用因子との結合能,転写活性化への影響を解析している.
2)Nrf2が転写応答する場の同定および解析
Nrf2の転写応答における相互作用因子の影響を調べるために,TRRAP(昨年度相互作用分子として同定)およびBRG1のノックダウン細胞を作成し,Nrf2標的遺伝子座へのリクルートをクロマチン免疫沈降法により検討した.TRRAPノックダウン細胞では,Nrf2の標的配列へのリクルートが増強していたが,BRG1ノックダウン細胞では,Nrf2結合への影響は認められなかった.一方Nrf2ノックダウンによりBRG1のリクルートは消失した.現在,上記テトラサイクリン誘導性Nrf2発現細胞を用いて,Nrf2標的遺伝子座へのNrf2および相互作用因子のリクルートを検討している.さらに,Nrf2およびFLAGに対する抗体を用いて,Nrf2変異体の核内局在を検討している.
3)DEMに応答するレポーター遺伝子の作成
RNAiライブラリーを用いてNrf2の親電子性物質応答に関与する因子をスクリーニングするために、ヒトまたはマウスNOO1およびHO-1遺伝子のNrf2標的配列を含むプロモーター領域に緑色蛍光タンパク質遺伝子(GFP)またはチミジンキナーゼ遺伝子を連結したレポーター構築を作製した.これらレポーター構築を安定導入した細胞を作製後、スクリーニングを開始する.
|
