超音波遺伝子導入法を用いた仮骨延長部位へのWNT遺伝子導入による骨形成能促進効果

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17390546
• Research Institution: Tsurumi University
• Principal Investigator: 瀬戸 かん一 鶴見大学, 歯学部, 教授 (60064367)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 丸山 一雄 帝京大学, 薬学部, 教授 (30130040) ; 根岸 洋一 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (50286978) ; 田村 正人 北海道大学, 大学院, 教授 (30236757) ; 滝澤 知子 帝京大学, 薬学部, 助手 (90260934) ; 関谷 秀樹 東邦大学, 医学部, 講師 (70267540)
• Keywords: 仮骨延長法 / 遺伝子導入 / 超音波刺激 / 骨形成 / WNT / 非ウイルスベクター / メカニカルストレス / FGF

Research Abstract

本年度は、WNT関連遺伝子の非ウイルスベクター合成を行い、培養骨系細胞にelectrophoration(電気的導入)遺伝子導入法により導入し、発現効率を検討した。さらにマウス大腿骨骨折仮骨モデルに導入し、導入状況をLacZ遺伝子(beta-galactosidase染色にて発現を確認)にて肉眼で観察した。そして、遺伝子導入された仮骨を単純X線、μCTや病理組織(トルイジンブルー染色、免疫染色)にて観察し、さらに、仮骨部分を骨より剥離しRNA抽出を行い、今回申請の機械を用いた定量RT-PCR法やWestern Blotting法にて、仮骨の変化に関する定量的検査を行った。
その対比として、メカニカルストレス存在下の骨分化調節因子として重要なFGFシグナルを活性化するために、非ウイルスベクターによるFGF遺伝子をマウス骨折モデルの仮骨部分に対して電気的に導入した。
その結果、仮骨周囲の筋組織にWNT3a遺伝子が導入されることによって、持続的にWNTタンパクを仮骨へ向かって放出することが確認された。そのWNTタンパクによって仮骨量は増大したが、その本態は、軟骨増生することが結果として明らかになった。
一方、FGF遺伝子に関しては、骨芽細胞様細胞と線維芽細胞を増殖させ、さらに骨化促進が見られた。
すなわち、WNTによる軟骨増生の後、仮骨のシャフトの太さは太くなるが、その後さらにFGFによる線維性仮骨への分化とメカニカルストレスによる骨化の促進により、骨量を増幅させることが可能であろう。この2つの遺伝子導入の組み合わせを臨床応用すれば、仮骨延長後には、シャフトの太く長い再建骨が得られることが予想され、今後さらに、この組み合わせでの実験を試みる予定である。