プロテオーム解析に基づく微生物培養フェーズの解析と菌体外酵素生産制御

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17560686
• Research Institution: Kitami Institute of Technology
• Principal Investigator: 堀内 淳一 北見工業大学, 工学部・化学システム工学科, 教授 (30301980)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 多田 清志 北見工業大学, 工学部・化学システム工学科, 助手 (90333666)
• Keywords: プロテオーム / 生物・生体工学 / バイオテクノロジー / バイオリアクター / 酵素

Research Abstract

1.目的
枯草菌の培養において現れる増殖期からアミラーゼ生産期、胞子形成における細胞内および細胞外の遺伝子産物量を2次元電気泳動を用いて経時的に調べ、その動的変化を追跡し、プロテオーム解析を行い細胞内情報を反映した新たな培養フェーズ解析を試みる。本年度は、種々の培養状態における遺伝子産物の動態変化の解析を行った。
2.実験方法
菌株には、アミラーゼ生産菌であるBacillus amyloliquefaciens(ATCC-23350)を用いた。容積5Lの小型発酵槽を用いて回分培養を行い、菌体増殖期、アミラーゼ生産期において得られた菌体サンプルを用いて、酵素活性測定および2次元電気泳動を行った。また、2次元電気泳動マップからのタンパク質の同定は、画像解析を行い、2次元電気泳動データベースを用いた。
3.結果
種々の培養状態におけるセントラルメタボリズムに関与する細胞内酵素(グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルピン酸キナーゼ等)の酵素活性測定を行なった結果、主要エネルギー代謝に関わる酵素の発現がグルコース濃度に大きく依存し、微生物の生理学的状態と主要酵素の活性とが密接に関連していることがわかった。また、細胞内の遺伝子産物を二次元電気泳動により解析した結果、セントラルメタボリズムに関与する酵素の同定が可能であった。一方、細胞外の遺伝子産物を解析した結果、増殖期では殆どタンパク質スポットを検出できなかったが、アミラーゼ生産期では約50のスポットが検出された。これは、カタボライト抑制の解除とともにアミラーゼを含む様々な酵素の生産が開始されたためと考えられる。これらのことから、アミラーゼ生産における枯草菌の培養状態の変化を2次元電気泳動で解析しうることが明らかになった。